【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因編輯領域，特別是規律成簇的間隔短回文重復(crispr)。具體而言，本專利技術涉及一種新型的crispr酶(或者，稱之為crispr蛋白、cas效應蛋白、cas酶或cas蛋白)，包含此類蛋白的融合蛋白，以及編碼它們的核酸分子。本專利技術還涉及用于核酸編輯(例如，基因或基因組編輯)的復合物和組合物，其包含本專利技術的cas蛋白或融合蛋白，或編碼它們的核酸分子。
技術介紹
1、crispr/cas技術是一種被廣泛使用的基因編輯技術，它通過rna引導對基因組上的靶序列進行特異性結合并切割dna產生雙鏈斷裂，利用生物非同源末端連接或同源重組進行定點基因編輯。
2、crispr/cas9系統是最常用的ii型crispr系統，它識別3’-ngg的pam基序，對靶標序列進行平末端切割。crispr/cas?type?v系統是一類新發現的crispr系統，它具有5’-ttn的基序，對靶標序列進行粘性末端切割，例如cpf1,c2c1,casx,casy。然而目前存在的不同的crispr/cas各有不同的優點和缺陷。例如cas9,c2c1和casx均需要兩條rna進行指導rna，而cpf1只需要一條指導rna而且可以用來進行多重基因編輯。casx具有980個氨基酸的大小，而常見的cas9，c2c1，casy和cpf1通常大小在1300個氨基酸左右。此外，cas9，cpf1，casx，casy的pam序列都比較復雜多樣，而c2c1識別嚴謹的5’-ttn，因此它的靶標位點比其他系統容易被預測從而降低了潛在的脫靶效應。>
3、總之，鑒于目前可獲得的crispr/cas系統都受限于一些缺陷，開發一種更穩健的、具有多方面良好性能的新型crispr/cas系統對生物技術的發展具有重要意義。
技術實現思路
1、本申請的專利技術人經過大量實驗和反復摸索，出人意料地發現了一種新型核酸內切酶(cas酶)?；谶@一發現，本專利技術人開發了新的crispr/cas系統以及基于該系統的基因編輯方法和核酸檢測方法。
2、cas效應蛋白
3、一方面，本專利技術提供了一種cas蛋白，所述cas蛋白是crispr/cas系統中的效應蛋白，在本專利技術，將其稱之為cas-sf6106。
4、在一個實施方式中，所述cas蛋白氨基酸序列與seq?id?no.1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物學功能。優選的，所述cas蛋白與cas-sf6106來源于同一物種。
5、在一個實施方式中，所述cas蛋白氨基酸序列與seq?id?no.1相比，具有一個或多個氨基酸的置換、缺失或添加的序列；并且基本保留了其源自的序列的生物學功能；所述一個或多個氨基酸的置換、缺失或添加包括1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個氨基酸的置換、缺失或添加。優選的，所述cas蛋白與cas-sf6106來源于同一物種。
6、本領域技術人員清楚，可以改變蛋白質的結構而不對其活性和功能性產生不利影響，例如，可以在蛋白質氨基酸序列中引入一個或多個保守性氨基酸取代，而不會對蛋白質分子的活性和/或三維結構產生不利影響。本領域技術人員清楚保守性氨基酸取代的實例以及實施方式。具體的說，可以用與待取代位點屬于相同組的另一氨基酸殘基取代該氨基酸殘基，即用非極性氨基酸殘基取代另一非極性氨基酸殘基，用極性不帶電荷的氨基酸殘基取代另一極性不帶電荷的氨基酸殘基，用堿性氨基酸殘基取代另一堿性氨基酸殘基，和用酸性氨基酸殘基取代另一酸性氨基酸殘基。這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的。只要取代不導致蛋白質生物活性的失活，則一種氨基酸被屬于同組的其他氨基酸替換的保守取代落在本專利技術的范圍內。因此，本專利技術的蛋白可以在氨基酸序列中包含一個或多個保守性取代,這些保守性取代最好根據下表進行替換而產生。另外，本專利技術也涵蓋還包含一個或多個其他非保守取代的蛋白，只要該非保守取代不顯著影響本專利技術的蛋白質的所需功能和生物活性即可。
7、保守氨基酸置換可以在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基處進行?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢园l生改變(缺失、取代或置換)而不改變生物活性的氨基酸殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需的?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基替代的置換。氨基酸置換可以在上述cas蛋白的非保守區域中進行。一般而言，此類置換不對保守的氨基酸殘基，或者不對位于保守基序內的氨基酸殘基進行，其中此類殘基是蛋白質活性所需的。然而，本領域技術人員應當理解，功能變體可以具有較少的在保守區域中的保守或非保守改變。
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10、本領域熟知，可以從蛋白質的n和/或c末端改變(置換、刪除、截短或插入)一或多個氨基酸殘基而仍保留其功能活性。因此，從cas蛋白的n和/或c末端改變了一或多個氨基酸殘基、同時保留了其所需功能活性的蛋白，也在本專利技術的范圍內。這些改變可以包括通過現代分子方法例如pcr而引入的改變，所述方法包括借助于在pcr擴增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸編碼序列而改變或延長蛋白質編碼序列的pcr擴增。
11、應認識到，蛋白質可以以各種方式進行改變，包括氨基酸置換、刪除、截短和插入，用于此類操作的方法是本領域通常已知的。例如，可以通過對dna的突變來制備上述蛋白的氨基酸序列變體。還可以通過其他誘變形式和/或通過定向進化來完成，例如，使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，結合相關的篩選方法，來進行單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。
12、本領域技術人員能夠理解，本專利技術cas蛋白中的這些微小氨基酸變化可以出現(例如天然存在的突變)或者產生(例如使用r-dna技術)而不損失蛋白質功能或活性。如果這些突變出現在蛋白的催化結構域、活性位點或其它功能結構域中，則多肽的性質可改變，但多肽可保持其活性。如果存在的突變不接近催化結構域、活性位點或其它功能結構域中，則可預期較小影響。
13、本領域技術人員可以根據本領域已知的方法，例如定位誘變或蛋白進化或生物信息系的分析，來鑒定本專利技術cas蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化結構域、活性位點或其它功能結構域也能夠通過結構的物理分析而確定，如通過以下這些技術：如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，結合推定的關鍵位點氨基酸的突變來確定。
14、在一個實施方式中，所述cas蛋白含有seq?id?no.1所示的氨基酸序列。
15、在一個實施方式中，所述cas蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
16、在一個實施方式中，所述cas蛋白是與具有seq?id?no.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白為以下I-III任一所述的Cas蛋白：
2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括權利要求1所述的Cas蛋白和其他的修飾部分。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為編碼權利要求1所述Cas蛋白的多核苷酸序列，或編碼權利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。
4.一種載體，其特征在于，所述載體包含權利要求3所述的多核苷酸以及與之可操作連接的調控元件。
5.一種CRISPR-Cas系統，其特征在于，所述系統包括權利要求1所述的Cas蛋白以及gRNA，所述gRNA能夠結合權利要求1所述的Cas蛋白。
6.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含：
7.一種工程化的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4所述的載體，或權利要求5所述的CRISPR-Cas系統，或權利要求6所述的組合物。
8.權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核
9.一種編輯靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸的方法，所述方法包括將靶核酸與權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4所述的載體，或權利要求5所述的CRISPR-Cas系統，或權利要求6所述的組合物，或權利要求7所述的宿主細胞進行接觸。
10.一種檢測樣品中靶核酸的方法，所述方法包括將樣品與權利要求1所述的Cas蛋白、gRNA(指導RNA)和單鏈核酸檢測器接觸，所述gRNA包括與所述Cas蛋白結合的區域和與靶核酸雜交的指導序列；檢測由所述Cas蛋白切割單鏈核酸檢測器產生的可檢測信號，從而檢測靶核酸；所述單鏈核酸檢測器不與所述gRNA雜交。
...【技術特征摘要】
1.一種cas蛋白，其特征在于，所述cas蛋白為以下i-iii任一所述的cas蛋白：
2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括權利要求1所述的cas蛋白和其他的修飾部分。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為編碼權利要求1所述cas蛋白的多核苷酸序列，或編碼權利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。
4.一種載體，其特征在于，所述載體包含權利要求3所述的多核苷酸以及與之可操作連接的調控元件。
5.一種crispr-cas系統，其特征在于，所述系統包括權利要求1所述的cas蛋白以及grna，所述grna能夠結合權利要求1所述的cas蛋白。
6.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含：
7.一種工程化的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求1所述的cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4所述的載體，或權利要求5所述的crispr-cas系統，或權利要求6所述的組合物。
8.權利要求1所述的cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉銳恒，李珊珊，趙慶芝，
申請(專利權)人：山東舜豐生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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