【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生態環境、基因工程及分子生物，具體涉及一種cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用。
技術介紹
1、重金屬元素在人們的日常生活中廣泛存在，由于其在農業、工業與醫療業的普遍應用使得它們在土壤以及水體中均有所分布。在過去的幾年中，由于重工業的飛速發展，重金屬污染的土壤明顯增加，由于重金屬污染難以通過物理或化學方法有效降解，它們對地球的生態環境以及人類的身體健康造成嚴重的影響。而重金屬污染的水體一方面如果直接飲用可能會造成一些疾病甚至死亡，另一方面會通過各種食物鏈逐級遞增，富集到人體中，影響身體健康。因此，解決這樣的重金屬污染是重中之重。
2、銅是一類過度金屬，它的原子序數為29，原子量為63.5，也是世界上第三大的常用金屬。銅對于植物與動物的生長都具有不可替代的意義。在人體中，銅能夠促進血紅蛋白以及血紅素的生成，維持正常的造血功能。除此以外，銅對于抗氧化作用以及維持中樞神經系統的完整性也有著重要作用。然而，當銅過量時，往往會引起較為嚴重的氧化應激和組織損傷。一般情況下，與銅毒性相關的氧化應激部分是其氧化還原反應性的結果，例如游離銅或低分子量銅配合物催化超氧陰離子與過氧化氫之間產生羥基自由基，此外，銅也可以直接與半胱氨酸的游離硫醇結合，引起蛋白質氧化損傷活性。當人體攝入大量銅鹽時，往往會產生急性中毒的現象，患者會頭暈、嘔吐、腹痛、心跳加速、呼吸困難、溶血性貧血甚至肝腎衰竭死亡。當攝入的銅在組織中過量時，可能會引起威爾遜氏病(wilson's?disease)，如果能及時識別這種疾病，就可以采用
3、銅的最大濃度水平需要嚴格的調控，這就要求人們能夠使用合理的方法治理銅污染。一般來說，化學沉淀法是最為常用的策略，向銅污染水中加入沉淀劑，金屬陽離子與沉淀劑反應從而形成不溶性物質，與水完成分離，這種方法成本不高，能耗較低，操作也較為安全，但是處理后會產生大量淤泥，需要處置這種淤泥的成本較高，并且如果重金屬離子的濃度較低的情況下，使用化學沉淀法也難以見效。此外，離子交換技術也可以用于除去重金屬，通過離子交換樹脂與廢水中的金屬交換陽離子的能力來去除水體中的重金屬，這種方法沒有淤泥產生，去除重金屬的能力強，同時對去除的重金屬還有一定的選擇性，但是用于離子交換的樹脂需要再生，而再生液的處理成本十分高昂。除了這兩種方法外，混凝、膜過濾、電化學方法、吸附也都是常用的去除重金屬的技術。相比于這些傳統方法，生物修復因其支持環境可持續性和經濟循環而成為一種更具有競爭力的修復技術，微生物用于重金屬離子的吸附更為廣泛。微生物進行金屬吸附一般包括兩個階段，第一個階段金屬離子與細胞表面無活性的組分結合，獨立于細胞代謝過程，而第二個階段是將金屬離子吸附進入細胞質中，這個階段涉及細胞代謝過程。藻類細胞表面存在多種類型的金屬離子結合基團，包括羥基、羧基、磷酰基、胺、咪唑等等，這些結合基團使細胞表明的凈電荷為負，更有利于吸附重金屬離子。
4、萊茵衣藻(chlamydomonas?reinhardtii)是一種常見的單細胞微生物，已完成全基因組序列測序，培養周期短，并且對金屬脅迫有著較高的耐受性，目前廣泛用于金屬修復以及生態毒理學的研究中。萊茵衣藻有多種方式抵御重金屬脅迫，在其細胞表面有著細胞外聚合物(extracellular?polymeric?substances，eps)，細胞外聚合物由多糖、蛋白質、核酸和腐殖質組成，具有較強的結合金屬離子的能力，因此，金屬離子會與細胞壁以及細胞外聚合物結合，從而達成積累金屬的效應。其次，萊茵衣藻細胞能夠通過膜轉運調節以及細胞內絡合維持金屬穩態，在萊茵衣藻細胞內，有a組轉運蛋白以及b組轉運蛋白，a組轉運蛋白將金屬離子轉運至衣藻細胞質內，而b組轉運蛋白將衣藻細胞質中的金屬離子轉運至細胞器中。萊茵衣藻也能夠通過植物螯合肽、硫氧還蛋白、谷胱甘肽等大分子物質降低重金屬對細胞的毒害。
5、在基因突變技術日漸成熟的今天，許多研究者能夠構建萊茵衣藻新的突變株在全基因組范圍內進行基因遺傳或功能鑒定，從而更好地研究突變基因在萊茵衣藻抗銅功能中所起的作用。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，旨在提高萊茵衣藻藻株在生產實際的重金屬含銅廢水中的耐受性，以增加其生物量及吸附效率，從而提高生物修復含銅廢水的能力。此外，本專利技術還可為后續深入研究cyp720b1基因如何影響衣藻內部各種氧化應激反應及金屬轉運、代謝相關蛋白的表達與活性及相關脅迫細胞器功能提供了便利，后期將為萊茵衣藻重金屬銅代謝機制的理論研究及重金屬生物修復的應用研究奠定堅實的基礎。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用的技術方案是：
3、cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，所述cyp720b1基因的核苷酸序列如seq?id?no?1所示，所述cyp720b1基因的插入突變能夠提高萊茵衣藻對銅離子脅迫的耐受性。
4、進一步的，所述cyp720b1基因的編碼區能編碼cyp720b1蛋白質，該編碼區的核苷酸序列如seq?id?no?2所示；所述cyp720b1蛋白質的氨基酸序列如seq?id?no?3所示。
5、進一步的，為了實現cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，實施方案包括以下步驟：
6、(1)構建野生型萊茵衣藻突變體文庫，將抗性基因片段aphviii隨機整合入衣藻基因組，造成隨機插入突變；
7、(2)通過銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法，篩選目標藻株，提取突變體細胞的基因組；
8、(3)利用resda-pcr技術擴增突變位點序列，測序及萊茵衣藻基因組數據庫比對，發現aphviii片段插入cyp720b1基因3’utr區域。所述萊茵衣藻基因組數據庫為，數據庫版本為chlamydomonas?reinhardtii?v5.6，網址為，https://phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search。
9、由此獲得本專利技術所述cyp720b1基因突變型萊茵衣藻藻株，經銅離子生長曲線及吸附效率的測定，發現突變型藻株的生長速率更快，且具有較高的銅離子耐受性；同時顯示突變型藻株對于銅離子的吸附效率具有一定的提高。
10、優選的，步驟(1)中，所述抗性基因片段aphviii為萊茵衣藻常規抗性篩選基因片段，具有巴龍霉素抗性。該基因為廣泛應用于萊茵衣藻細胞株中的篩選基因片段。
11、進一步的，步驟(2)中，所述銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法為在4本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.CYP720B1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，所述CYP720B1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No?1所示，所述CYP720B1基因的插入突變能夠提高萊茵衣藻對銅離子脅迫的耐受性。
2.根據權利要求1所述的CYP720B1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，所述CYP720B1基因的編碼區能編碼CYP720B1蛋白質，該編碼區的核苷酸序列如SEQ?ID?No?2所示；所述CYP720B1蛋白質的氨基酸序列如SEQ?ID?No?3所示。
3.根據權利要求1所述的CYP720B1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的CYP720B1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(1)中，所述抗性基因片段aphVIII為萊茵衣藻常規抗性篩選基因片段，具有巴龍霉素抗性。
5.根據權利要求3所述的CYP720B1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(2)中，所述銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法為在400μM?Cu2
6.根據權利要求3所述的CYP720B1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(3)中，所述RESDA-PCR技術所用的擴增引物為，第一輪PCR反應所用引物為特異引物outer-R和四個簡并性引物DegAlu?I、DegTaq?I、DegSac?II、DegPst?I；第二輪PCR反應所用引物為特異引物inner-R和簡并引物上特異結合位點引物Q0；引物outer-R、引物DegAlu?I、引物DegTaq?I、引物DegSac?II、引物DegPst?I、引物inner-R、引物Q0的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No?4、SEQ?ID?No?5、SEQ?ID?No?6、SEQ?ID?No?7、SEQ?ID?No8、SEQ?ID?No9、SEQ?ID?No?10所示。
7.根據權利要求3所述的CYP720B1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(3)中，所述RESDA-PCR技術所設置的第一輪PCR反應程序為：
...【技術特征摘要】
1.cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，所述cyp720b1基因的核苷酸序列如seq?id?no?1所示，所述cyp720b1基因的插入突變能夠提高萊茵衣藻對銅離子脅迫的耐受性。
2.根據權利要求1所述的cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，所述cyp720b1基因的編碼區能編碼cyp720b1蛋白質，該編碼區的核苷酸序列如seq?id?no?2所示；所述cyp720b1蛋白質的氨基酸序列如seq?id?no?3所示。
3.根據權利要求1所述的cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(1)中，所述抗性基因片段aphviii為萊茵衣藻常規抗性篩選基因片段，具有巴龍霉素抗性。
5.根據權利要求3所述的cyp720b1基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(2)中，所述銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法為...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王亮，李亞，蔣林，徐闖，王蘇慧，錢蘊瑤，吳怡瓊，董周舟，師媛媛，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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