【技術實現步驟摘要】
本申請涉及基因檢測領域，具體地，涉及一種使用錨定多重pcr檢測肺癌融合基因的引物組合、試劑盒和方法。
技術介紹
1、基因突變和基因融合都會引起癌癥的發生。融合基因是指兩個不同基因的部分或全部序列相連形成的新的混合基因，其編碼產生的融合蛋白能夠介導腫瘤的發生發展。參見刊載于中國肺癌雜志2023年11月第26卷第11期的《基于rna-based?ngs檢測非小細胞肺癌融合基因臨床實踐中國專家共識》，近十年，靶向治療極大地改善了肺癌患者的預后。除表皮生長因子受體(ep?i?derma?l?growth?factor?receptor,egfr)等基因突變，在肺癌中針對變性淋巴瘤激酶(anap?l?ast?i?c?l?ymphoma?k?i?nase,alk)、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ros?proto-oncogene?1,receptor?tyros?i?ne?k?i?nase,ros1)、轉染時重排(rearranged?dur?i?ng?transfect?i?on,ret)等融合基因的靶向藥物也陸續在國內外獲批上市并應用于臨床，為患者帶來了更多的治療機會，顯著改善了攜帶融合基因變異患者的生存質量和預后。
2、基因融合是通過染色體反轉(chromosoma?l?i?nvers?i?on)、串聯復制(tandemdup?l?i?cat?i?on)、缺失(de?l?et?i?on)或易位(trans?l?ocat?i?on)，合并不同的、獨立的基因或基因片段的過程。基因融合與各種疾病，尤其與癌癥的發生發展
3、多重pcr(mu?l?t?i?p?l?ex?po?l?ymerase?cha?i?n?react?i?on，mpcr)也稱復合pcr，是在1988年首次提出。其基本原理與常規pcr相同，區別在于多重pcr反應體系加入兩對及以上的引物，各對引物分別結合在模板相對應部位，同時擴增出多個核酸片段的pcr反應。多重pcr可以通過優化反應體系和反應條件提高擴增的片段數量。
4、錨定pcr(anchored?pcr)常用于擴增已知一端序列的目的dna。在未知序列一端加上一段多聚dg的尾巴，然后分別用多聚dc和已知的序列作為引物進行pcr擴增。與多重pcr結合使用時被稱為錨定多重pcr(amp)。
5、現有測序技術方法存在的主要問題有：1、現有的普通多重pcr法須知曉與重要融合基因發生融合的基因，并根據不同融合方式設計不同的引物來進行檢測，因此無法檢測出未知的融合基因以及未知的融合方式；2、現有普通多重pcr方法引物成本高(2317元)，且對樣本投入量(100ng以上)要求較高；3.錨定多重pcr可能存在非目標reads百分比偏高的問題；4.錨定多重pcr可能存在均一性較差的問題。
技術實現思路
1、本專利技術提出了一種引物組合，其包括seq?id?no：1-40的引物。引物序列詳見實施例1和序列表。
2、所述引物組合包含分別保存的第一引物組和第二引物組；所述第一引物組包含seq?id?no：1-20的引物，所述第二引物組包含seq?id?no：21-40的引物。
3、所述第一引物組中，每種引物的物質的量相同；所述第二引物組中各引物的物質的量比例為：seq?id?no：21-26，每種引物1份；seq?id?no：27-29，每種引物2份；seq?id?no：30-33，每種引物3份；seq?id?no：34，4份；seq?id?no：35-37，每種引物5份；seq?id?no：38-39，每種引物6份；seq?id?no：40，7份。
4、本專利技術還提供一種試劑盒，所述試劑盒包含所述的引物組合。
5、作為一種優選的方案，所述試劑盒還包含seq?id?no：41-42所示的接頭和seq?idno：43所示的錨定引物。
6、作為更優選的一種方案，所述試劑盒具有最小包裝組合，所述最小包裝組合包括：內含0.6μm第一引物組的容器a，內含0.6μm第二引物組的容器b，內含seq?id?no：41-42所示的接頭各0.75μm的容器c，分別內含0.6μm的seq?id?no：43所示的錨定引物的容器d和容器e，所述第一引物組、第二引物組具有本專利技術說明書表1和表2限定的引物和物質的量比例。
7、本專利技術提供了一種肺癌融合基因的檢測方法，使用本專利技術的引物組合或試劑盒，使用錨定多重pcr方法檢測alk、hmbs、lrp1、met、mrpl、ntrk1、ntrk2、ntrk3、ret、ros1和tbp基因相關的融合基因。
8、所述檢測方法包含以下步驟：(1)核酸提取，(2)rna片段化和隨機引物結合，(3)cdna一鏈合成，(4)cdna二鏈合成，(5)接頭連接，(6)連接產物純化，(7)第一輪半巢式pcr擴增，(8)第一輪半巢式pcr產物純化，(9)第二輪半巢式pcr擴增，(10)第二輪半巢式pcr產物純化，(11)終文庫擴增，(12)終文庫純化與質檢，(13)ngs上機測序。
9、所述步驟(5)使用seq?id?no：41和42的接頭。
10、本專利技術所稱的第一引物組也可稱為g1?poo?l，第二引物組也可稱為g2?poo?l。所述步驟(7)第一輪半巢式pcr擴增使用seq?id?no：1-20的引物和seq?id?no：43的錨定引物，退火溫度為60℃；所述步驟(9)第二輪半巢式pcr擴增使用seq?id?no：21-40的引物和seqid?no：43的錨定引物，退火溫度為60℃。
11、本專利技術中alk、hmbs、lrp1、met、mrpl、ntrk1、ntrk2、ntrk3、ret、ros1和tbp相關的融合基因，指發生融合的其中一個基因選自alk、hmbs、lrp1、met、mrpl、ntrk1、ntrk2、ntrk3、ret、ros1和tbp，另一個基因則不受限制，因此，盡管實施例中受本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種引物組合，其包括SEQ?ID?NO：1-40的引物。
2.根據權利要求1所述的引物組合，其包含分別保存的第一引物組和第二引物組；所述第一引物組包含SEQ?ID?NO：1-20的引物，所述第二引物組包含SEQ?ID?NO：21-40的引物。
3.根據權利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述第一引物組中，每種引物的物質的量相同；所述第二引物組中各引物的物質的量比例為：
4.一種試劑盒，其特征在于，包含權利要求1-3任一項所述的引物組合。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包含SEQ?ID?NO：41-42所示的接頭和SEQ?ID?NO：43所示的錨定引物。
6.根據權利要求5所示的試劑盒，其特征在于，其具有最小包裝組合，所述最小包裝組合包括：內含0.6μM第一引物組的容器A，內含0.6μM第二引物組的容器B，內含SEQ?ID?NO：41-42所示的接頭各0.75μM的容器C，分別內含0.6μM的SEQ?ID?NO：43所示的錨定引物的容器D和容器E，所述第一引物組、第二引物組具有權利要求3限定的引物和物
7.一種肺癌融合基因的檢測方法，其特征在于，使用權利要求1-3任一項所示的引物組合或權利要求4-6任一項所示的試劑盒，使用錨定多重PCR方法檢測ALK、HMBS、LRP1、MET、MRPL、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1和TBP基因相關的融合基因。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包含以下步驟：(1)核酸提取，(2)RNA片段化和隨機引物結合，(3)cDNA一鏈合成，(4)cDNA二鏈合成，(5)接頭連接，(6)連接產物純化，(7)第一輪半巢式PCR擴增，(8)第一輪半巢式PCR產物純化，(9)第二輪半巢式PCR擴增，(10)第二輪半巢式PCR產物純化，(11)終文庫擴增，(12)終文庫純化與質檢，(13)NGS上機測序。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(5)使用SEQ?ID?NO：41和42的接頭。
10.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(7)第一輪半巢式PCR擴增使用SEQ?ID?NO：1-20的引物和SEQ?ID?NO：43的錨定引物，退火溫度為60℃；所述步驟(9)第二輪半巢式PCR擴增使用SEQ?ID?NO：21-40的引物和SEQ?ID?NO：43的錨定引物，退火溫度為60℃。
...【技術特征摘要】
1.一種引物組合，其包括seq?id?no：1-40的引物。
2.根據權利要求1所述的引物組合，其包含分別保存的第一引物組和第二引物組；所述第一引物組包含seq?id?no：1-20的引物，所述第二引物組包含seq?id?no：21-40的引物。
3.根據權利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述第一引物組中，每種引物的物質的量相同；所述第二引物組中各引物的物質的量比例為：
4.一種試劑盒，其特征在于，包含權利要求1-3任一項所述的引物組合。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包含seq?id?no：41-42所示的接頭和seq?id?no：43所示的錨定引物。
6.根據權利要求5所示的試劑盒，其特征在于，其具有最小包裝組合，所述最小包裝組合包括：內含0.6μm第一引物組的容器a，內含0.6μm第二引物組的容器b，內含seq?id?no：41-42所示的接頭各0.75μm的容器c，分別內含0.6μm的seq?id?no：43所示的錨定引物的容器d和容器e，所述第一引物組、第二引物組具有權利要求3限定的引物和物質的量比例。
7.一種肺癌融合基因的檢測方法，其特征在于，使用權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：莊坤東，潘兆東，李莉，謝洪濤，王勇斯，溫韻潔，全智慧，裘宇容，
申請(專利權)人：廣州華銀醫學檢驗中心有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。