【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于定量來自樣品的靶核酸的組合物、試劑盒和方法。特別地，本文所述的實施方案使得能夠在與靶核酸序列相同的反應體積內使用內部定量標準物(iqs)來定量靶核酸。
技術介紹
1、檢測感興趣的靶核酸序列的測定廣泛用于分子生物學和醫學，特別是聚合酶鏈式反應(pcr)過程。臨床應用通常涉及從受試者收集樣品，提取核酸，并且在靶標特異性引物的存在下使提取的樣品經受擴增條件。因此，擴增產物的存在表明靶核酸存在于樣品中，而未能測量到擴增產物則表明靶核酸不存在或以對于檢測而言太低的水平存在。因此，此類測定可用于檢測和監測病原性疾病，以及其他應用(諸如環境樣品的分析)。
2、標準定量聚合酶鏈式反應(qpcr)過程通過監測與靶序列的擴增相關的靶標特異性熒光信號來測量靶dna的擴增。輸出是定量循環(cq)值，其指示對應于靶序列的熒光信號超過背景熒光閾值水平的pcr循環數。cq值與樣品中的靶核酸的量成反比。即，較低的cq值表示較高量的靶核酸，而較高的cq值表示較低量的靶核酸(或pcr過程的問題)。然而，cq值不直接指示樣品中靶核酸的實際濃度。
3、有時通過生成將cq值與靶核酸濃度相關的標準曲線來實現確定測試樣品中的靶核酸的量。通過擴增一系列已知濃度的靶核酸并測量所得cq值來生成標準曲線。盡管在一些應用中是有益的，但生成標準曲線需要進行若干獨立的反應。這降低了產量，因為附加的反應體積(例如，孔板中的孔)必須專用于標準曲線樣品，并且需要附加的操作員時間以及附加的設備和試劑使用。此外，標準曲線不能容易地解釋反應之間的“孔對孔”(
4、因此，存在對定量來自樣品的靶核酸的系統、方法、試劑盒和其他實施方案的持續需要。
技術實現思路
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種用于定量測試樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是病毒核酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述靶核酸是SARS-CoV-2核酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述靶標特異性引物對SARS-CoV-2的Orf1a基因、Orf1b基因、N基因或S基因中的一者或多者的至少一部分有特異性。
5.根據權利要求2所述的方法，其中所述靶核酸來自人免疫缺陷病毒(HIV)。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述靶標特異性引物對HIV的gag區域、LTR區域、整合酶區域或pol區域中的一者或多者的至少一部分有特異性。
7.根據權利要求1的所述方法，其中所述IQS是外源核酸。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述IQS是合成核酸。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶標特異性引物和所述IQS特異性引物不同，使得所述靶核酸的擴增與所述IQS的擴增是非競爭性的。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶標特異性引物中的至少一
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述靶標特異性引物和所述IQS特異性引物是相同的。
12.根據權利要求10所述的方法，還包括使用被配置為與所述靶核酸的擴增子相關的靶標特異性探針和被配置為與所述IQS的擴增子相關的IQS特異性探針，其中所述靶標特異性探針和所述IQS特異性探針是不同的。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述靶標特異性探針和所述IQS特異性探針具有不同的序列。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述靶標特異性探針和所述IQS特異性探針具有共享約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個堿基的重疊序列區域。
15.根據權利要求12所述的方法，其中所述靶標特異性探針和所述IQS特異性探針具有不同的染料標記。
16.根據權利要求1所述的方法，其中擴增所述靶核酸的至少一部分的步驟包括逆轉錄反應。
17.根據權利要求1所述的方法，其中擴增所述IQS的至少一部分的步驟包括逆轉錄反應。
18.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(c)和步驟(d)的所述擴增同時進行。
19.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法在不使用標準曲線來確定所述測試樣品中的所述靶核酸的所述量的情況下進行。
20.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法在不使用被動參考對照染料的情況下進行。
21.根據權利要求1所述的方法，其中所述RQ值被確定為：
22.根據權利要求1所述的方法，其中所述RQ值被確定為：
23.根據權利要求1所述的方法，其中所述校正因子通過以下步驟確定：
24.根據權利要求23所述的方法，其中通過測量多個已知濃度下所述靶標和IQS的多個Cq值來確定所述校正因子。
25.根據權利要求24所述的方法，其中通過對所述多個已知濃度的所述Cq值比率求平均值來確定所述校正因子。
26.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的所述量(靶標量)通過下式確定：
27.根據權利要求1所述的方法，還包括從原始樣品中提取所述靶核酸以形成所述測試樣品。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述IQS在所述提取之前添加到所述原始樣品。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述IQS是裝甲的。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述IQS是裝甲的，任選地其中所述IQS是使用MS2外殼蛋白裝甲的并且/或者是具有噬菌體MS2載體作為裝甲RNA的哺乳動物RNA病毒載體。
31.根據權利要求1所述的方法，還包括：
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述內源核酸是核糖核酸酶P(RNaseP)，并且其中所述內源序列引物對RNaseP有特異性。
33.根據權利要求31所述的方法，還包括：
34.根據權利要求31所述的方法，其中所述靶核酸的擴增效率與所述IQS和/或內源核酸的擴增效率相差不超過約50％、不超過約45％、不超過約40％、不超過約35％、不超過約30％、不超過約25％、不超過約20％、不超過約15％、不超過約10％、不超過約9％、不超過...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種用于定量測試樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是病毒核酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述靶核酸是sars-cov-2核酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述靶標特異性引物對sars-cov-2的orf1a基因、orf1b基因、n基因或s基因中的一者或多者的至少一部分有特異性。
5.根據權利要求2所述的方法，其中所述靶核酸來自人免疫缺陷病毒(hiv)。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述靶標特異性引物對hiv的gag區域、ltr區域、整合酶區域或pol區域中的一者或多者的至少一部分有特異性。
7.根據權利要求1的所述方法，其中所述iqs是外源核酸。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述iqs是合成核酸。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶標特異性引物和所述iqs特異性引物不同，使得所述靶核酸的擴增與所述iqs的擴增是非競爭性的。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶標特異性引物中的至少一個靶標特異性引物與所述iqs特異性引物中的至少一個iqs特異性引物相同。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述靶標特異性引物和所述iqs特異性引物是相同的。
12.根據權利要求10所述的方法，還包括使用被配置為與所述靶核酸的擴增子相關的靶標特異性探針和被配置為與所述iqs的擴增子相關的iqs特異性探針，其中所述靶標特異性探針和所述iqs特異性探針是不同的。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述靶標特異性探針和所述iqs特異性探針具有不同的序列。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述靶標特異性探針和所述iqs特異性探針具有共享約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個堿基的重疊序列區域。
15.根據權利要求12所述的方法，其中所述靶標特異性探針和所述iqs特異性探針具有不同的染料標記。
16.根據權利要求1所述的方法，其中擴增所述靶核酸的至少一部分的步驟包括逆轉錄反應。
17.根據權利要求1所述的方法，其中擴增所述iqs的至少一部分的步驟包括逆轉錄反應。
18.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(c)和步驟(d)的所述擴增同時進行。
19.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法在不使用標準曲線來確定所述測試樣品中的所述靶核酸的所述量的情況下進行。
20.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法在不使用被動參考對照染料的情況下進行。
21.根據權利要求1所述的方法，其中所述rq值被確定為：
22.根據權利要求1所述的方法，其中所述rq值被確定為：
23.根據權利要求1所述的方法，其中所述校正因子通過以下步驟確定：
24.根據權利要求23所述的方法，其中通過測量多個已知濃度下所述靶標和iqs的多個cq值來確定所述校正因子。
25.根據權利要求24所述的方法，其中通過對所述多個已知濃度的所述cq值比率求平均值來確定所述校正因子。
26.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的所述量(靶標量)通過下式確定：
27.根據權利要求1所述的方法，還包括從原始樣品中提取所述靶核酸以形成所述測試樣品。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述iqs在所述提取之前添加到所述原始樣品。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述iqs是裝甲的。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述iqs是裝甲的，任選地其中所述iqs是使用ms2外殼蛋白裝甲的并且/或者是具有噬菌體ms2載體作為裝甲rna的哺乳動物rna病毒載體。
31.根據權利要求1所述的方法，還包括：
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述內源核酸是核糖核酸酶p(rnasep)，并且其中所述內源序列引物對rnasep有特異性。
33.根據權利要求31所述的方法，還包括：
【專利技術屬性】
技術研發人員：S·L·孔，S·M·劉，A·英，M·R·富爾塔多，G·Y·H·王，D·肯尼，J·H·Y·潘，X·徐，
申請(專利權)人：生命科技公司，
類型：發明
國別省市：
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