【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及蛋白質(zhì)，尤其涉及一種多肽片段連接方法和多肽蛋白質(zhì)的合成方法。
技術(shù)介紹
1、蛋白質(zhì)化學(xué)合成能夠獲得傳統(tǒng)生物重組表達(dá)技術(shù)等方法難以或不可能獲取的蛋白質(zhì)樣品，如位點(diǎn)特異性翻譯后修飾蛋白、鏡像蛋白和同位素標(biāo)記蛋白等。蛋白質(zhì)化學(xué)合成已用于生物化學(xué)、生物醫(yī)藥等研究領(lǐng)域。
2、蛋白質(zhì)化學(xué)合成主要依賴固相多肽合成技術(shù)和化學(xué)選擇性多肽連接技術(shù)。1963年，merrifield專利技術(shù)了固相多肽合成技術(shù)，使得化學(xué)合成多肽成為現(xiàn)實(shí)。由于在樹脂上組裝多肽時(shí)，每接入一個(gè)氨基酸都要經(jīng)歷一次氨基和羧基的縮合反應(yīng)以及一次氨基保護(hù)基脫除反應(yīng)，使得固相多肽合成技術(shù)出現(xiàn)缺陷難以克服。一方面是，難以保證每個(gè)反應(yīng)100％的反應(yīng)效率，特別是大位阻氨基酸的縮合反應(yīng)可能性較低；另一方面是，當(dāng)在樹脂上組裝的肽鏈較長(zhǎng)時(shí)，肽鏈會(huì)發(fā)生聚集效應(yīng)而形成特殊結(jié)構(gòu)，從而不利于縮合反應(yīng)和保護(hù)基脫除反應(yīng)的進(jìn)行。由于雜質(zhì)的積累可能導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)品難以或無法去除，固相合成多肽通常只能實(shí)現(xiàn)約50個(gè)氨基酸殘基的多肽合成。而更長(zhǎng)多肽蛋白的獲取主要依靠化學(xué)選擇性多肽連接技術(shù)，其包括自然化學(xué)連接、二硒-硒酯連接、酮酸-羥胺連接及絲氨酸/蘇氨酸連接等連接反應(yīng)。這些連接反應(yīng)通常在含有鹽酸胍或尿素等離液鹽的中性水溶液中進(jìn)行，有時(shí)也在dmf/h2o、吡啶/乙酸等含有機(jī)溶劑的混合溶劑中進(jìn)行。利用這些連接方法，已經(jīng)合成了大量蛋白質(zhì)，如胰島素、hiv-1蛋白酶、泛素化組蛋白、糖基化促紅細(xì)胞生成素等。
3、但是，盡管親水性多肽片段的連接在上述溶劑條件下通常能夠順利進(jìn)行，但研究表明，很多疏水
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題在于提供一種多肽片段連接方法和多肽蛋白質(zhì)的合成方法。所述多肽片段連接方法可應(yīng)用于親水性蛋白或者疏水性蛋白的合成，解決了疏水性蛋白合成困難的問題。
2、為達(dá)到以上目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：
3、本專利技術(shù)提供了一種多肽片段連接方法，包括以下步驟：
4、將式a所示的多肽醛基片段和式b所示的多肽二硫醇片段在酸性環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，得到式c所示的含有環(huán)狀硫縮醛結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物；
5、
6、其中，q1選自c6～c18的亞芳基或c1～c10的亞烷基；
7、q4和q5獨(dú)立的選自亞甲基或亞乙基。
8、所述酸性環(huán)境可以使得多肽片段或蛋白質(zhì)溶解。
9、本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述酸性環(huán)境為ph<2的酸性環(huán)境。
10、所述ph<2的酸性環(huán)境，優(yōu)選的，由鹽酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、水、乙腈、二氯甲烷中的一種或多種提供，且至少含有鹽酸或三氟乙酸或甲酸或乙酸中的一種。
11、本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述q1選自c6～c12的亞芳基或c1～c6的亞烷基；
12、優(yōu)選的，所述q4和q5均選自亞甲基。
13、本專利技術(shù)提供了一種多肽蛋白質(zhì)的合成方法，包括以下步驟：
14、1)將式1和式2所示多肽在酸性環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，得到式3所示的含有環(huán)狀硫縮醛結(jié)構(gòu)的第一反應(yīng)物；
15、2)將上述第一反應(yīng)物在緩沖溶液中進(jìn)行分子內(nèi)自然化學(xué)連接反應(yīng)，制備得到式4所示多肽中間體；
16、3)將所述式4所示多肽中間體進(jìn)行化學(xué)切割除去可移除基團(tuán)，制備得到
17、式5所示多肽蛋白質(zhì)；
18、
19、其中，q1選自c6～c18的亞芳基或c1～c10的亞烷基。
20、所述c6～c18的亞芳基包括但不限于亞苯基、亞萘基、亞聯(lián)苯基、亞蒽基、亞菲基、亞芘基等。
21、所述c1～c10的亞烷基包括但不限于亞甲基、亞乙基、亞正丙基、亞異丙基、亞正丁基、亞異丁基、亞叔丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛基、亞壬基、亞癸基等。
22、所述c1～c10的亞烷基還含有取代基。
23、所述取代基包括但不限于鹵素、硝基、氨基、羥基等。
24、q2選自含巰基氨基酸。
25、q3選自可移除基團(tuán)。
26、q4和q5獨(dú)立的選自亞甲基或亞乙基。
27、本專利技術(shù)更優(yōu)選的，所述q1選自c6～c12的亞芳基或c1～c6的亞烷基。
28、優(yōu)選的，q2選自含巰基氨基酸。
29、優(yōu)選的，q3選自可移除基團(tuán)。
30、本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)選的，所述q1選自亞苯基、亞萘基、亞聯(lián)苯基、亞甲基、亞乙基、亞丙基中的一種或多種。
31、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述q2選自半胱氨酸、β-巰基纈氨酸，β-巰基亮氨酸、β-巰基苯丙氨酸、γ-巰基賴氨酸、γ-巰基異亮氨酸、γ-巰基蘇氨酸、δ-巰基色氨酸或甘氨酸輔基。
32、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述q3選自rbm(removable?backbone?modification，可移除骨架修飾)、phacm保護(hù)基、類dde保護(hù)基或光脫除保護(hù)基。
33、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述q4和q5獨(dú)立的選自亞甲基或亞乙基。
34、本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述c6～c18的亞芳基的取代基選自甲酸基、乙酸基、甲基、乙基、丙基中的一種或多種。
35、本專利技術(shù)更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述式1具有以下任一所示結(jié)構(gòu)：
36、
37、更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述式2的結(jié)構(gòu)如下所示：
38、
39、上述六種式2的結(jié)構(gòu)中，式2-1結(jié)構(gòu)的可移除基團(tuán)rbm可安裝在除脯氨酸(p)外的任意氨基酸的α氨基上，最后可用三氟乙酸或鹽酸脫除；式2-2結(jié)構(gòu)的可移除基團(tuán)phacm可安裝在半胱氨酸(c)的側(cè)鏈巰基上，最后可用鈀脫除；式2-3結(jié)構(gòu)的可移除基團(tuán)類dde可安裝在賴氨酸(k)的側(cè)鏈氨基上，最后可用肼脫除；式2-4結(jié)構(gòu)的二硫醇可直接安裝在賴氨酸(k)的側(cè)鏈氨基上，最后可用酶脫除；式2-5結(jié)構(gòu)的二硫醇可直接安裝在絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)的側(cè)鏈羥基上，最后可用堿脫除；式2-6結(jié)構(gòu)的可移除基團(tuán)可安裝在谷氨酰胺(q)或天冬酰胺(n)的側(cè)鏈酰胺上，最后可用光脫除。
40、本專利技術(shù)優(yōu)選的，所述步驟1)中的酸性環(huán)境為ph<2的酸性環(huán)境。
41、上述合成方法中，所述式1和式2所示多肽的摩爾比優(yōu)選為(0.8～1.2)：1。
42、然后將第一反應(yīng)物經(jīng)過分子內(nèi)自然化學(xué)連接反應(yīng)制備得到本專利技術(shù)所述的多肽蛋白質(zhì)。
43、所述分子內(nèi)自然化學(xué)連接反應(yīng)需要在弱堿性、中性或弱酸性緩沖溶液中進(jìn)行。
44、優(yōu)選的，所述步驟2)中緩沖溶液的ph為4～8.5。
45、所述緩沖溶液具體包括但不限于水相變性溶液的磷酸鹽溶液，有機(jī)共溶劑的磷酸鹽溶液，h2o、py、acoh混合溶液，h2o、ch3cn、py、acoh混合溶液等。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種多肽片段連接方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽片段連接方法，其特征在于，所述酸性環(huán)境為pH<2的酸性環(huán)境。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽片段連接方法，其特征在于，所述Q1選自C6～C12的亞芳基或C1～C6的亞烷基；
4.一種多肽蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述Q1選自C6～C12的亞芳基或C1～C6的亞烷基；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述Q1選自亞苯基、亞萘基、亞聯(lián)苯基、亞甲基、亞乙基、亞丙基中的一種或多種；
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述C6～C18的亞芳基的取代基選自甲酸基、乙酸基、甲基、乙基、丙基中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述式1具有以下任一所示結(jié)構(gòu)：
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述步驟1)中的酸性環(huán)境為pH<2的酸性環(huán)境；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的合成方
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種多肽片段連接方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽片段連接方法，其特征在于，所述酸性環(huán)境為ph<2的酸性環(huán)境。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽片段連接方法，其特征在于，所述q1選自c6～c12的亞芳基或c1～c6的亞烷基；
4.一種多肽蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述q1選自c6～c12的亞芳基或c1～c6的亞烷基；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述q1選自亞苯基、亞萘基、亞聯(lián)苯基、亞甲基、亞乙...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭基深，黃棟梁，唐姍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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