本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料及其制備方法；本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種智能型組織工程支架材料及技術(shù)，特別涉及一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料以及方法技術(shù)。本發(fā)明專利技術(shù)材料具有如下特性：３７℃時表面相對疏水，適于細(xì)胞黏附／鋪展和增殖，但在３２℃下呈現(xiàn)親水性，細(xì)胞自動從表面脫附。細(xì)胞培養(yǎng)支架材料制備方法包括以下步驟：（１）表面清洗；（２）ＴＣＰＳ表面的溫敏羧基化修飾（３）制備胺基乳糖酸（Ｌ－ＮＨ２）；（４）ＴＣＰＳ表面的糖化修飾。本發(fā)明專利技術(shù)增強(qiáng)支架材料的生物相容性和細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，增加細(xì)胞在材料表面的吸附率，得到適用于肝組織工程的智能型支架材料。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種智能型組織工程支架材料及技術(shù)，特別涉及一種溫度敏感型肝細(xì) 胞培養(yǎng)支架材料以及方法技術(shù)。
技術(shù)介紹
我國是肝病的高發(fā)區(qū)，其中重型肝炎/肝衰竭是病情最重、死亡率最高的肝臟疾 病之一。治療重型肝炎/肝衰竭的三種常用方法為內(nèi)科治療、肝移植和人工代用品治療。由 于肝供體的缺乏及手術(shù)費(fèi)用的昂貴，在我國肝移植難以得到普遍應(yīng)用，而人工代用品由于 不能完全替代人體器官的所有功能，不能根據(jù)人體自身要求進(jìn)行相應(yīng)的自動調(diào)節(jié)，所以不 能治愈疾病，只能暫時緩解癥狀或者短期延續(xù)病人的生命。組織工程概念的提出，為解決這 一難題提供了寶貴的理論依據(jù)。組織工程學(xué)的方法是將特定的組織細(xì)胞“種植”于一種生物相容性良好、可被人 體逐步降解吸收的生物材料(組織工程材料)上，形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物；生物材料為 細(xì)胞的增長繁殖提供三維空間和營養(yǎng)代謝環(huán)境；隨著材料的降解和細(xì)胞的繁殖，形成新的 具有與自身功能和形態(tài)相應(yīng)的組織或器官；這種具有生命力的活體組織或器官能對病損組 織或器官進(jìn)行結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能的重建，并達(dá)到永久替代。其中生物材料在組織工程中占據(jù) 非常重要的地位，它不僅影響細(xì)胞的生物學(xué)行為和培養(yǎng)效率，而且還決定著移植后能否與 機(jī)體很好的適應(yīng)、結(jié)合和修復(fù)，是限制組織工程能否真正應(yīng)用于臨床的一個關(guān)鍵因素。目前組織工程支架材料有兩類一類是天然基質(zhì)材料，如膠原、纖維連接蛋白、層 連蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、殼聚糖等，它們均具有較好的生物相容性，但所形成的支架材 料穩(wěn)定性和機(jī)械性能較差；一類是合成高分子聚合物，如聚ε 己內(nèi)酯乙烷基乙烯基磷酸 鹽共聚物(PCLEEP)、聚乙酰內(nèi)酯(PVLA)、聚乳酸一羥基乙酸共聚物(PLGA)等，它們具有良 好的力學(xué)性能和生物降解性能，但在生物相容性方面仍有一定的缺陷。為了解決以上材料 問題，當(dāng)前的研究多采用復(fù)合修飾和改性的方法，用于揚(yáng)長避短，以獲得一種良好的生物材 料。如馬祖?zhèn)ィ唛L友等發(fā)表的文章1型膠原在聚-L-乳酸(PLLA)表面的化學(xué)接枝和涂 層及其對軟骨細(xì)胞生長的促進(jìn)作用；雜志為.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)(2004，25 (4) :749-752)。 采用接枝一涂層技術(shù)，在聚-L-乳酸(PLLA)膜表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA)，利用水溶性 碳化二亞胺作為縮合劑，使表面的羧基和膠原分子中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，從而將I型膠 原接枝在PLLA表面，并對軟骨細(xì)胞在其表面的生長行為進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，改性表面 有效地提高了細(xì)胞在材料表面的粘附、增殖和鋪展。浦鳴，計(jì)劍等發(fā)表的文章反應(yīng)性梳狀聚 乙二醇改性聚酯薄膜表面及其內(nèi)皮細(xì)胞相容性的研究。雜志為高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)(2006， 27(5) :951-955)。將高密度梳狀PEG(CPEG)端羥基轉(zhuǎn)化為反應(yīng)活性較高的醛基，通過表 面接枝方法對氨基化的聚酯膜進(jìn)行表面改性，用整合素配體多肽片段(RGD)和氨基酸修飾 CPEG，獲得了細(xì)胞相容性優(yōu)良的功能化仿生表面。半乳糖由于具有與肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)進(jìn)行特異性結(jié)合 的功能，多被引入材料以增加肝細(xì)胞的粘附率。Inn-kyu Kang等發(fā)表的文章Graftingoflactose-carring styrene onto polystyrene dishes using plasma glow discharge and theirinteraction with hepatocytes.雜 志 為J. Mater. Sci. :Mater. M(2003, 14:611-616)通過輝光放電等離子體方法將半乳糖基苯乙烯類化合物(VLA)接枝到 聚苯乙烯板表面，并對肝細(xì)胞在此載體表面的培養(yǎng)情況作了研究。Yoon等發(fā)表的文 章 Surfaceimmobilization of galactose onto aliphatic biodegradable polymers for hepatocyte culture.雜志為 Biotechnol Bioeng(2002，78 :1_10)將半乳糖引入 聚乳酸乙醇酸(PLGA)膜，將之用于肝細(xì)胞培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，隨膜表面半乳糖濃度 的增加，肝細(xì)胞的吸附能力和活性增強(qiáng)ο Higashiyama等發(fā)表的文章:Mixed-ligand modificationofpolyamidoa mine dendrimers to develop an effective scaffold for maintenance ofhepatocyte spheroids.雜志為 J. Biomed. Mater. Res(2003,64A 475-82)將果糖和半乳糖的復(fù)合配體修飾到聚苯乙烯表面，制備了能保持肝細(xì)胞球形結(jié)構(gòu) 的改性表面° 卓仁禱等發(fā)表了文章Immobilization of galactose ligands on acrylic acidgraft-copolymerized poly (ethylene terephthalate)film and its application to hepatocyteculture.雜志為 Biomacromolecules (2003，4 :157-165)將半乳糖修飾到 PET表面，研究了肝細(xì)胞在此改性表面的吸附能力和細(xì)胞功能等。關(guān)于肝組織工程支架材料方面雖然取得很多有意義的研究成果，但按照傳統(tǒng)的組 織工程方法，當(dāng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后形成細(xì)胞片層或組織，要連同支架材料一起移植入 主體，這樣會引起很多復(fù)雜的問題(1)支架材料在體內(nèi)降解后，其先前所占據(jù)的空間會被 細(xì)胞外基質(zhì)充滿，從而使細(xì)胞不能緊密聚集，肝臟是一種細(xì)胞緊密聚集的器官，這樣就使移 植入主體的細(xì)胞在體內(nèi)的生長不能很好的模擬本體組織；(2)對于較大的結(jié)構(gòu)，在支架材 料周圍，移植細(xì)胞會健康成長且與本體組織很相似，但由于是被動傳輸，營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和 代謝廢物的排出較慢，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)中心部位的細(xì)胞活性喪失，從而形成一個壞死的中心；(3) 一些支架材料，如聚乳酸(PLA)、甲殼素等的降解產(chǎn)物的酸堿會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性； (4) 一些支架材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙酸醇(PGA)等，降解成小分子碎片，會引起主體內(nèi) 巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞的聚集，這些免疫細(xì)胞也會吞噬植入細(xì)胞。Okano Τ. , et al.. Biomaterials,2005,26 =415-6422.這些問題的存在，大大限制了組織工程的發(fā)展。高分子材料表面改性方法包括化學(xué)法、輻射接枝法、等離子體方法、紫外光固定 法，其中化學(xué)法接枝工藝復(fù)雜，試劑浪費(fèi)大，有的試劑還有毒，而且反應(yīng)時間長；輻射接枝法 會將放射性引入反應(yīng)體系；等離子體方法需要真空、高溫條件，需要設(shè)備復(fù)雜，投資成本高。采用紫外光固定法對高聚物表面接枝改性的研究很多，但大多為對聚乙烯(PE)、 聚丙烯(PP)、滌綸(PET)等的改性，如李斌，周曉工等的文章聚丙烯表面接枝PNIPAAm膜 I.光接枝反應(yīng)和表面形態(tài)結(jié)構(gòu)研究，雜志為高分子學(xué)報(bào)(2002,6:780-785)。通過紫外光 照射法在聚丙烯薄膜上接枝PNIPAAm，研究了不同反應(yīng)條件對接枝反應(yīng)的影響。金朝鋒申 屠寶卿等的文章高密度聚乙烯表面光接枝丙烯酸行為研究，雜志為化本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，含有Ｎ－異丙基丙烯酰胺，其特征在于聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板上接枝Ｎ－異丙基丙烯酰胺和丙烯酸，丙烯酸的羧基通過縮合連接胺基乳糖酸的胺基；所述肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料具有如下特性：３７℃時表面相對疏水，適于細(xì)胞黏附／鋪展和增殖，但在３２℃下呈現(xiàn)親水性，細(xì)胞自動從表面脫附。
【技術(shù)特征摘要】
一種溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料，含有N 異丙基丙烯酰胺，其特征在于聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板上接枝N 異丙基丙烯酰胺和丙烯酸，丙烯酸的羧基通過縮合連接胺基乳糖酸的胺基；所述肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料具有如下特性37℃時表面相對疏水，適于細(xì)胞黏附/鋪展和增殖，但在32℃下呈現(xiàn)親水性，細(xì)胞自動從表面脫附。2.一種如權(quán)利要求1所述的溫度敏感型肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料的制備方法，包括以下步驟(1)表面清洗將聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板用無水乙醇沖洗，蒸餾水沖洗，55-65°C真空干燥；(2)聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板表面的溫敏羧基化修飾將NIPAAm和AAc溶于DMS0，再加入 蒽醌-2-磺酸鈉，滴入幾滴異丙醇；將處理好的TCPS樣品放入上述反應(yīng)液中，通N215分鐘 密封，高壓汞燈處理，然后依次以無水乙醇、蒸餾水沖洗接枝樣品，真空干燥ld，得聚苯乙烯 細(xì)胞培養(yǎng)板溫敏羧基化表面產(chǎn)物(TCPS-NIPA-AAc)；(3)制備胺基乳糖酸將乳糖酸和乙二胺分別溶于DMSO中，溫度70 80°C反應(yīng)2 4h，將混合物溶液傾入氯仿中沉析，然后將產(chǎn)物胺基乳糖酸真空干燥。(4)聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板表面的糖化修飾將胺基乳糖酸和溶于pH= 6. 0 9. 4的磷 酸鹽緩沖溶液；將TCPS-NIPA-AAc樣品放入其中，置于搖床上室溫下震蕩1 3d，反應(yīng)體系 中加入1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；蒸餾水浸泡洗滌，真空干燥，得目標(biāo) 肝細(xì)胞培養(yǎng)支架材料。3...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳莉，賀曉凌，聶萍萍，趙義平，
申請(專利權(quán))人：天津工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：12[中國|天津]
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