【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞培養基，尤其涉及一種誘導性多能干細胞的培養基及其應用。
技術介紹
1、誘導性多能干細胞（induced?pluripotent?stem?cells,?ipscs）最初是通過將四個轉錄因子的組合（oct4、klf4、sox2、c-myc,?oskm）轉入到分化的體細胞中，使其重編程而得到。此后，ipscs已從多種細胞類型和多個物種中獲得，表明了這是一種普遍的分子機制。ipscs不僅具有胚胎干細胞（embryonic?stem?cells,?es細胞）的多能性，而且來源豐富，對再生醫學來說，有著不可估量的潛在價值。因此，越來越多的研究者使用?ipscs來模擬身體組織、器官和其他系統的發育；不僅如此，還可以通過對患者樣本的重新編程，進行疾病建模；此外，人類?ipscs?也已經成為新的細胞療法和藥物發現的基礎，并已達到臨床應用。
2、相關技術中，大多數的誘導性多能干細胞（ipscs）的培養體系中含有血清，例如胎牛血清（fbs）。作為細胞培養中最常用的添加劑，血清提供了細胞在體外培養（增殖、分化等）所必需的蛋白、營養素、激素和生長因子等等。然而，血清的成分復雜，整個組成在很大程度上還未知，而且批次之間存在著顯著差異，成分不確定性以及批次間差異很容易導致可重復性的下降。不僅如此，含有血清的培養基無法規避動物血清中的異源體，而使用動物血清培養的細胞，會存在人體異源體排斥和沖突；而且，即便經過過濾、篩選等，血清中仍然有可能存在潛在的感染性病原體，例如極小的病毒或朊病毒等，從而使其安全性下降，最終也使得ipscs在
3、為了規避這些問題，已經研發出用于ipscs的無血清培養基，例如包含血清替代物（kosr）的無血清培養基。然而，該體系成分仍然不完全明確，依然具有含胎牛血清培養基的一些缺點（例如批次之間的可變性），而且有報道指出其培養的細胞還存在細胞增殖速度慢等問題。不僅如此，血清替代物例如人血小板裂解液（hpl）還存在著可用性不足以及供體之間疾病傳播的可能性，仍然存在爭議。另一種策略是采用完全化學添加劑的培養基培養ipscs，雖然該培養基在大多數情況下無異源細胞，但滿足ipscs正常培養所需的添加劑組合非常昂貴，大大限制了其在臨床應用的潛在價值，而且不同的添加劑組合通常只適用于特定的細胞類型。
4、因此，提供一種無血清、成分明確、批次差異小、安全性好，且兼具經濟價值和臨床應用價值的普適性的ipscs培養基對研究ipscs機理、藥物篩選以及ipscs的應用顯得尤為重要。
技術實現思路
1、本專利技術旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本專利技術提出一種誘導性多能干細胞的培養基及其應用，旨在提供一種無血清、成分明確、批次差異小、安全性好、普適性好的ipscs培養基，以解決目前ipscs培養基中，含血清培養基存在成分不明確、批次間差異顯著、存在人體異源體排斥、安全性不足的問題，而化學添加劑培養基存在價格昂貴、普適性差的問題，為ipscs的轉化和臨床研究提供有力支持。
2、本專利技術第一方面的實施例，提供了一種誘導性多能干細胞的培養基，所述培養基包括基礎培養基和添加劑；所述添加劑包括黃烷酮、丁香酸、天麻素、芝麻素、馬錢苷、黃豆黃素、龍膽苦苷、山姜素、羥基積雪草苷、山奈素；所述培養基不含有血清。
3、根據本專利技術第一方面實施例的誘導性多能干細胞的培養基，至少具有如下有益效果：本專利技術提供的誘導性多能干細胞（ipscs）的培養基，在基礎培養基中添加了小分子化合物組合作為添加劑。本專利技術培養基不含血清，通過添加小分子化合物組合的策略，改善了ipscs的培養基條件，為血清依賴的ipscs培養提供了新的思路和策略。上述ipscs培養基具有以下優勢：
4、（1）不含血清，成分完全明確；避免了血清培養基存在的成分不確定性以及批次間差異，培養基批次間可重復性好；規避了使用血清可能導致的異源體成分引起的排斥和沖突，安全性高，臨床的應用價值和潛力大大提升。
5、（2）與傳統血清培養基相比，本專利技術的無血清ipscs培養基更適合ipscs細胞增殖以及細胞的克隆性，同時保持與傳統培養基大致相似的微觀方面以及細胞大小；而且培養的ipscs細胞也表現出更顯著的線粒體代謝，細胞活性更好，也更有助于ipscs細胞培養后產生的各種組織工程替代品的臨床轉化。
6、（3）本專利技術所述的添加劑均為天然存在的小分子化合物，無毒副作用，保證了后續應用的安全性；搭配合理，各成分間協同作用，能提供各類細胞來源的ipscs生長增殖所需的營養環境，普適性好；而且上述小分子化合物價格低廉，能夠替代原有培養基中大多數價格昂貴的添加劑，大大降低了ipscs的培養成本，為后續ipscs的產業化應用提供了可能，具有極為可觀的經濟效益和應用前景。
7、本專利技術的上述添加劑中：
8、黃烷酮，又稱2,3-二氫黃酮、2-苯基苯并吡喃-4-酮、2-苯基苯并二氫吡喃-4-酮，英文名flavanone?(2,3-dihydroflavone,?4-flavanone,?2-phenyl-4-chromanone,?2-phenylchroman-4-one)，分子式c15h12o2，cas號：487-26-3。黃烷酮具有較強的抗氧化和清除自由基活性，可減少某些慢性疾病的風險、阻滯一些心血管疾病以及某些癌癥。黃烷酮還具有抗病毒、抗菌、消炎活性，對毛細管脆性有一定改善效果、抑制人血小板凝聚、抗潰瘍、降低過敏反應。黃烷酮可以與丁香酸共同作用，起到清除自由基、防止細胞氧化的功能。
9、丁香酸，又稱nsc?2129、syra，英文名syringic?acid，分子式c9h10o5，cas號：530-57-4。丁香酸是一種有效的抗氧化中草藥，是具有潛在的抗血管生成、抗糖基化、抗高血糖、神經保護和增強記憶的活性。可以與黃烷酮共同作用，起到清除自由基、防止細胞氧化的功能。
10、天麻素，又稱天麻苷，英文名gastrodin?(gastrodine)，分子式c13h18o7，cas號：62499-27-8。天麻素是一種多元酚（4-羥基芐醇的葡糖苷），是從中草藥天麻（gastrodiaelata）中提取的最重要也是最有效的成分，具有抗炎作用，長期以來一直用于頭暈、癲癇、中風和癡呆癥的研究。可以與芝麻素、馬錢苷、黃豆黃素、龍膽苦苷、山姜素、羥基積雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促進細胞增殖的功能。
11、芝麻素，英文名sesamin?(fagarol)，分子式c20h18o6，cas號：607-80-7。芝麻素是一種從花椒屬（fagara）植物的樹皮和芝麻油中分離出來的木脂素，是多不飽和脂肪酸生物合成中有效且選擇性的delta?5去飽和酶抑制劑，對腦缺血具有有效的神經保護作用。可以與天麻素、馬錢苷、黃豆黃素、龍膽苦苷、山姜素、羥基積雪草苷、山奈素共同作用，起到抗炎、抗菌、抗病毒活性及促進細胞增殖的功能。
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【技術保護點】
1.一種誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，所述培養基包括基礎培養基和添加劑；所述添加劑包括黃烷酮、丁香酸、天麻素、芝麻素、馬錢苷、黃豆黃素、龍膽苦苷、山姜素、羥基積雪草苷、山奈素；所述培養基不含有血清。
2.根據權利要求1所述的誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，以培養基的終濃度計：所述黃烷酮的濃度為0.05~1μM；所述丁香酸的濃度為0.1~1μM；所述天麻素的濃度為0.05~1μM；所述芝麻素的濃度為0.1~2μM；所述馬錢苷的濃度為0.05~1μM；所述黃豆黃素的濃度為0.05~1μM；所述龍膽苦苷的濃度為0.05~1μM；所述山姜素的濃度為0.05~1μM；所述羥基積雪草苷的濃度為0.05~1μM；所述山奈素的濃度為0.05~1μM。
3.根據權利要求2所述的誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，以培養基的終濃度計：所述黃烷酮的濃度為0.05~0.2μM；所述丁香酸的濃度為0.1~0.4μM；所述天麻素的濃度為0.05~0.2μM；所述芝麻素的濃度為0.1~1μM；所述馬錢苷的濃度為0.05~0.2μM；所述黃豆黃素的濃度為0.05~0.2μ
4.根據權利要求1所述的誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，所述添加劑還包括支持誘導性多能干細胞生長的以下組分：一種或多種脂類、一種或多種轉金屬蛋白及轉金屬蛋白替代物、一種或多種胰島素及胰島素替代物、一種或多種微量元素、一種或多種維生素、一種或多種氨基酸、一種或多種受體酪氨酸激酶、一種或多種激素以及一種或多種類激素化合物。
5.根據權利要求4所述的誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，所述添加劑包括以下組分：脂質濃縮液、轉鐵蛋白、結晶牛胰島素、硒、糖皮質激素、鹽酸異丙腎上腺素以及表皮細胞生長因子。
6.根據權利要求1所述的誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，所述基礎培養基包括DMEM、MEM、BME、F-12、RPMI?1640、GMEM中的至少一種。
7.一種如權利要求1-6任一項所述的誘導性多能干細胞的培養基在培養誘導性多能干細胞中的應用，所述應用為非診斷或治療目的。
8.一種誘導性多能干細胞，其特征在于，采用如權利要求1-6任一項所述的誘導性多能干細胞的培養基培養得到。
9.一種誘導性多能干細胞的培養方法，其特征在于，包括步驟：
10.一種如權利要求8所述的誘導性多能干細胞或者如權利要求9所述的培養方法培養得到的誘導性多能干細胞在構建疾病模型、新藥篩選、制備治療神經系統疾病或心血管系統疾病的藥物中的應用，所述應用為非診斷或治療目的。
...【技術特征摘要】
1.一種誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，所述培養基包括基礎培養基和添加劑；所述添加劑包括黃烷酮、丁香酸、天麻素、芝麻素、馬錢苷、黃豆黃素、龍膽苦苷、山姜素、羥基積雪草苷、山奈素；所述培養基不含有血清。
2.根據權利要求1所述的誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，以培養基的終濃度計：所述黃烷酮的濃度為0.05~1μm；所述丁香酸的濃度為0.1~1μm；所述天麻素的濃度為0.05~1μm；所述芝麻素的濃度為0.1~2μm；所述馬錢苷的濃度為0.05~1μm；所述黃豆黃素的濃度為0.05~1μm；所述龍膽苦苷的濃度為0.05~1μm；所述山姜素的濃度為0.05~1μm；所述羥基積雪草苷的濃度為0.05~1μm；所述山奈素的濃度為0.05~1μm。
3.根據權利要求2所述的誘導性多能干細胞的培養基，其特征在于，以培養基的終濃度計：所述黃烷酮的濃度為0.05~0.2μm；所述丁香酸的濃度為0.1~0.4μm；所述天麻素的濃度為0.05~0.2μm；所述芝麻素的濃度為0.1~1μm；所述馬錢苷的濃度為0.05~0.2μm；所述黃豆黃素的濃度為0.05~0.2μm；所述龍膽苦苷的濃度為0.05~0.2μm；所述山姜素的濃度為0.05~0.2μm；所述羥基積雪草苷的濃度為0.05~0.2μm；所述山奈素的濃度為0.05~0.2μm。
4.根據權利要求1所述的誘...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉佳，
申請(專利權)人：深圳市中佳生物醫療科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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