本發明專利技術涉及從山羊肌肉細胞分離的編碼Ｓ６Ｋ２蛋白的ｃＤＮＡ的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列。本發明專利技術通過比對已知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的核苷酸序列，找到保守區，然后根據牛Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登陸號ＸＭ－５８２４７８）設計出了一對用于ＲＴ－ＰＣＲ擴增羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ編碼區片段的引物并用這對引物通過ＲＴ－ＰＣＲ方法擴增出了特異性片段，測序后得到了羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的編碼區的４７９ｂｐ的核苷酸序列和與它的前４７７ｂｐ對應的氨基酸序列。獲得的這４７７ｂｐ的核苷酸序列可進一步用于羊Ｓ６Ｋ２基因全長ｃＤＮＡ的克隆及用于通過ＲＴ－ＰＣＲ或雜交的方法檢測Ｓ６Ｋ２基因的組織表達特異性，也可用于重組表達得到蛋白后制備檢測Ｓ６Ｋ２的抗體。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及從山羊肌肉細胞分離的編碼S6K2蛋白的cDNA，更具體地說涉及編碼S6K2蛋白質 的cDNA編碼區477bp的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列。
技術介紹
細胞生長調控是一個受多因素影響的復雜過程，它不僅受到時間和空間的限制，還受到營養條 件和細胞內外環境條件的影響。在營養條件合適并有其它剌激生長的因子存在時，細胞通過生物大分子合 成而使得質量和形態都得到增長，此時則表現為生長。盡管目前對細胞生長和細胞周期分裂是如何協調的 機制理解的還很少，但信號蛋白T0R (target of rapamycin)在從酵母到果蠅直至哺乳動物細胞中作為細 胞生長的中心協調器的作用已為人們所認識，這一在進化上保守的協調器調節著基本的生物加工過程。最 具特色的mT0R下游效應器包括兩條信號通路，即4E-BP1 (真核細胞翻譯啟始因子4E (elF4E)結合蛋白1) 和S6Ks (核糖體蛋白S6激酶)，形成了兩條平行的調節niRNA轉譯的信號通路。哺乳動物細胞中有兩種S6Ks蛋白，即S6K1和S6K2，它們分別由兩個基因所編碼。兩種蛋白在組成、 結構和功能等方面都是相近的。S6K2是一個屬于AGO激酶家族的Ser/Thr激酶。S6K2蛋白包含了 5個主 要的結構域，自N端始分另ij為NT (N-terminal domain), catalytic domain, the linker region, autoinhibitory domain和CT(C-terminal domain)。 S6K2有兩種形態，分別稱為S6K2卩1 (p70pl)和S6K鄰2 (p70卩2)。人 的S6K2 e 1含有495個氨基酸殘基，S6K2 P 2含有482個氨基酸殘基，二者僅在N端相差13個氨基酸并且 在S6K2Pl多出的13個氨基酸中包含了核定位信號。編碼p703和p70a的基因核苷酸序列的同源性為70%, 而氨基酸序列同源性為85%，進一步的結構分析表明，在S6K2的C端也有核定位信號，故S6K2的兩種形 態都是核型的。實驗證明S6K2在小鼠細胞生長和胚胎發育中起著重要的作用，S6K2影響著蛋白的合成和 細胞的生長。迄今，關于S6K2在哺乳動物細胞生長與增殖中發揮調節作用的研究已在人、鼠、牛等哺乳動物的細 胞中開展并取得了許多成果，但尚未見有關山羊細胞中S6K2的研究報道，也未見有山羊S6K2基因的cDNA 核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列的報道。在各種情況下，有重要的原因研究和開發與山羊S6K2蛋白相關的基因克隆及其重組表達，因為研究 清楚山羊的S6K2基因和蛋白的功能，可以用在提高細胞培養、胚胎移植和發育及出生后新生兒的存活的 質量等方面，由重組S6K2蛋白制備的抗體可以檢測S6K2基因在不同種類的細胞、不同的細胞周期及個 體的不同發育階段的表達情況
技術實現思路
本專利技術人己經努力從山羊的不同組織細胞中分離S6K2基因。作為結果，本專利技術人從山羊肌肉 組織細胞分離了 S6K2基因的cDNA編碼區479bp片段，并且確定了它的核苷酸序列和由它的前477bp推斷 出的氨基酸序列。本專利技術人通過比對己知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的S6K2基因的核苷酸序列，找 到保守區，然后根據牛的S6K2基因(XM-582478)cDNA編碼區的序列，設計出了一對用于通過RT-PCR方 法擴增山羊S6K2基因cDNA編碼區片段的簡并引物(上游引物稱為P1，下游引物稱為P2)，并應用這對引 物擴增出了特異性片段，測序后得到了山羊S6K2基因的cDNA編碼區479bp片段，序列分析表明與牛的序 列(XM-582478)同源性為98%(470/479),推導出的由此序列編碼的氨基酸序列與牛的相比有3個氨基酸 的差別。這一cDNA片段稱為"gS6K2"。所以，本專利技術的目的是通過己知的不同物種的S6K2的核苷酸序列設計簡并引物，然后通過RT-PCR方 法克隆山羊S6K2基因的cDNA編碼區片段。對該片段測序后提供編碼山羊S6K2蛋白的基因的cDNA的編 碼區477bp的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列(序列詳見序列表)。附圖的簡要說明從下面給出的說明結合附圖，本專利技術的上面目的的特征將變的明了。其中附圖說明圖1顯示了牛S6K2基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陸號XM-582478)。圖2顯示了 477 bp的山羊S6K2基因的cDNA的編碼區核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )和由此推斷的氨基酸 序列(SEQ ID NO: 2)。圖3是顯示從山羊肌肉組織分離的總RNA的RT-PCR的結果(479 bp的cDNA gS6K2)的電泳圖。 圖4是顯示以質粒PMD19-T-gS6K2為模板，以Pl、 P2為引物進行PCR鑒定的電泳圖。圖5是顯示將質粒pMD19-T-gS6K2進行酶切鑒定的電泳圖。圖6顯示了山羊S6K2基因cDNA的編碼區核苷酸序列與牛(XM-582478)的S6K2基因cDNA的序列的比 較。具體實施方式為了從山羊組織細胞中分離S6K2基因，本專利技術人首先按照提取RNA的標準要求采集內蒙 古白絨山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat, Cspra力/rcws )的各類組織樣本。艮卩，現場宰殺內蒙古 白絨山羊后立即采取肌肉、肝、腎、淋巴結、脾及睪丸等組織塊(將組織塊大小控制在30 50ug)，放入 冷凍管后立即入液氮保存，帶回實驗室后置于-8(TC冰箱保存備用。然后利用TaKaRa的總RNA提取試劑盒 (TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取山羊肌肉組織、睪丸組織、腎組織、肝組 織、淋巴結組織及脾臟組織的總RNA，最后根據文獻報道的哺乳動物S6K2基因在各類組織中的表達情況 和總RNA提取結果，選定以肌肉組織總RNA為模板進行反轉錄操作，得到cDNA第一鏈。再以此cDNA第_ 鏈為模板，利用特異性引物P1、 P2進行PCR擴增，得到目的片段。之后將電泳后分離的目的片段切膠回 收，測定雙鏈cDNA的濃度，與pMD19-T克隆載體連接構建成質粒pMD19-T-gS6K2。為了檢測連接反應是否成功和擴增質粒pMD19-T-gS6K2，將其轉化f co乃'DH5 a感受態細胞，然后將 此被質粒pMD19-T- gS6K2轉化了的DH5 a細胞涂在含有氨芐青霉素的選擇性平板上，并同時進行 藍、白菌落篩選。37'C培養16小時后選取白色的重組菌落再進行平板劃線培養12小時。作為結果，初步 認定白色菌落為獲得的重組菌落。重組菌落和重組質粒pMD19-T-gS6K2的進一步鑒定則分為三個步驟進行。首先挑取劃線培養的菌落用 Kieser法提質粒，再以此質粒為模板，用特異性引物Pl、 P2進行PCR鑒定，陽性的初步認定為重組質粒， 其相應的齒落則為重組菌落。然后，再挑取初步認定為重組的菌落進行液體培養，精提質粒，再以此精提 的質粒為模板進行PCR鑒定，陽性的質粒進一步進行單酶切和￡coi I /歷wdll雙酶切鑒定。經過 了 PCR和酶切雙重鑒定的質粒確定為重組質粒pMD19-T-gS6K2。作為結果，得到了顯示陽性反應的重組質 粒和重組菌落。將含有重組質粒pMD19-T-本文檔來自技高網...
【技術保護點】
獨立權利要求 本專利技術涉及一段從山羊肌肉細胞分離的編碼Ｓ６Ｋ２蛋白的ｃＤＮＡ，更具體地說涉及編碼Ｓ６Ｋ２蛋白質的ｃＤＮＡ編碼區核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列。目前應用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆基因并獲得相應的核苷酸序列是獲得基因（ｃＤＮＡ） 核苷酸序列的常用方法。本項專利技術設計了一對引物并應用這對引物通過ＲＴ－ＰＣＲ方法擴增出了山羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的編碼區特異性片段，經過測序后得到這一片段的４７９ｂｐ的核苷酸序列，其特征是在還沒有羊Ｓ６Ｋ２基因核苷酸序列的情況下，通過比較已知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的Ｓ６Ｋ２基因的核苷酸序列，找到保守區，然后根據牛Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ序列設計ＰＣＲ引物，進而通過ＲＴ－ＰＣＲ方法擴增出了山羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的編碼區片段，測序后得到了４７９ｂｐ的核苷酸序列和與它的前４７７ｂｐ對應的氨基酸序列，這一山羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ編碼區片段的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列在國內外是首次獲得。 基于上述說明的本專利技術的技術特征，本專利技術的獨立權利要求表述為：一種自山羊分離的多核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列，是下列序 列之一：１）序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的４７７ｂｐ的ｃＤＮＡ序列；２）與序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的ｃＤＮＡ序列對應的標注為ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的氨基酸序列。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王志鋼，劉東軍，旭日干，
申請(專利權)人：王志鋼，劉東軍，旭日干，
類型：發明
國別省市：15[中國|內蒙]
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