【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及一種重組蛋白內毒素的去除方法。
技術介紹
1、在生物制藥領域中，利用細胞培養技術生產的重組蛋白在醫療衛生事業中發揮著至關重要的作用。細胞培養液經過表達、澄清過濾、純化及制劑的無菌分裝、凍干等操作，制得重組蛋白。
2、內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞細胞后才釋放出來，且內毒素結構復雜，可以與溶液中的蛋白質結合形成復合物，增加了去除難度。然而，即使極微量的內毒素也會引起人體不良反應，輕則發熱，重則休克，由于這些不良反應，必須從藥物、注射劑和其他生物和藥品中去除內毒素。
3、去除內毒素的一些常用技術包括超濾法、親和吸附法、相分離法、離子交換色譜法。雖然，這些方法能夠去除部分內毒素，但是，單獨使用一種方法去除內毒素存在去除率低的弊端，難以達到動物可以耐受的水平的有效方法。
4、因此，有必要設計一種高效的技術方案克服上述缺陷，控制產品內毒素含量，保證患者安全。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中存在的技術問題，本專利技術提供了以下的技術方案：
2、本專利技術第一方面提供了一種重組蛋白內毒素的去除方法，所述去除方法包括：
3、1)收集細胞蛋白表達液，濃縮；
4、2)對步驟1)中的細胞蛋白表達濃縮液進行親和層析；
5、3)對步驟2)親和層析的產物進行triton?x-114處理。
6、進一步，所述步驟2)中親和層析的操作包括：通過f
7、進一步，所述細胞蛋白表達濃縮液的上樣濃度為35mg/毫升柱體積。
8、進一步，所述細胞蛋白表達濃縮液的上樣體積為5ml。
9、進一步，所述細胞包括昆蟲細胞、原核細胞、酵母、哺乳動物細胞、植物、禽類細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞及無細胞系統。
10、進一步，所述細胞包括cho細胞、hek293細胞。
11、進一步，所述cho細胞包括cho-dxb11、cho-k1、cho-dg44、cho-s。
12、術語“細胞”包括植物和動物細胞，并且包括無脊椎動物、非哺乳類脊椎動物和哺乳動物細胞。以上細胞均包括細胞群體及后代。示例性非哺乳類脊椎動物細胞包括，例如，禽類細胞、爬行動物細胞和兩棲動物細胞。示例性無脊椎動物細胞包括但不限于昆蟲細胞，例如蠋(草地貪夜蛾)細胞、蚊(埃及伊蚊)細胞、果蠅(黑腹果蠅)細胞。細胞可以為分化、部分分化或未分化的，例如干細胞，包括胚胎干細胞和多能干細胞。來源于器官或器官系統的額外的組織樣品可以根據本專利技術使用。示例性哺乳動物細胞包括，例如，來源于人，非人靈長類，貓，狗，綿羊，山羊，奶牛，馬，豬，兔，包括小鼠、倉鼠、大鼠和豚鼠在內的嚙齒類的細胞，以及其任何衍生物和后代。
13、術語“cho細胞”(chinese?hamster?ovary?cells)是一種來源于中國倉鼠卵巢細胞的實驗室培養細胞系。這種細胞系因其廣泛的生物學特性和在分子生物學研究中的應用而聞名。具體來說，cho細胞是一個上皮樣細胞，通常貼壁生長，也可以懸浮生長。它們被廣泛應用于表達重組dna的蛋白質，包括疫苗生產。
14、進一步，所述步驟3)中triton?x-114處理的具體操作包括：向步驟2)親和層析的產物添加triton?x-114，4℃攪拌孵育，室溫孵育，離心，取上清，得到內毒素去除的重組蛋白。
15、術語“親和層析”指一種層析模式，其中待分開的靶分子通過其與分子(例如根據本專利技術的包含重組蛋白和內毒素的溶液)的相互作用進行分離，所述分子與靶分子特異性相互作用。
16、進一步，所述添加triton?x-114的終濃度為1％。
17、進一步，所述4℃攪拌孵育的時間為25-35min。
18、在一些實施方案中，所述4℃攪拌孵育的時間為25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min。
19、進一步，所述室溫孵育的時間為15-25min。
20、在一些實施方案中，所述室溫孵育的時間為15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min。
21、進一步，所述離心的時間為15min，溫度為18-26℃，轉速為13000×g。
22、在一些實施方案中，所述離心的溫度為18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃。
23、進一步，所述fc平衡緩沖液組分為：20mm?tris，0.15m?nacl，6m?hcl。
24、進一步，所述fc淋洗液1組分為：50mm檸檬酸鈉，1m?nacl，6m?hcl。
25、進一步，所述fc淋洗液2組分為：50mm檸檬酸鈉，6m?hcl。
26、進一步，所述fc洗脫緩沖液組分為：0.1m?glycine，0.15m?nacl，25mm谷氨酰胺，12％海藻糖以及6m?hcl。
27、在一個具體的實施方案中，所述重組蛋白內毒素的去除方法包括如下步驟：收集細胞蛋白表達液，濃縮；通過fc洗脫緩沖液沖洗3倍柱體積，之后通過fc平衡緩沖液沖洗層析柱至uv280nm和電導率穩定，將蛋白表達濃縮液以35mg/毫升柱體積上樣5ml至層析柱，之后再通過fc平衡緩沖液沖洗層析柱至uv280nm回歸基線，之后依次通過fc淋洗液1、fc淋洗液2以及fc洗脫緩沖液洗脫，uv280nm≥10mau時開始收集，uv280nm≥10mau時結束收集；添加終濃度為1％的triton?x-114到收集液中，在4℃下孵育25～35分鐘，并進行攪拌。在室溫下繼續孵育15～25分鐘，之后在18～26℃條件下以13000×g轉速離心15分鐘，取上清，得到去除內毒素的重組蛋白。
28、術語“重組蛋白”特別地是指通過重組dna技術制備的蛋白質，其中通常將編碼表達蛋白質的dna插入合適的表達載體中，所述載體進而用于轉化或在病毒載體的情形下感染宿主細胞以制備異源蛋白。因此，如本文所用術語“重組蛋白”特別是指從重組dna分子表達的蛋白質分子。用于制備重組蛋白的合適系統包括(但不限于)昆蟲細胞(例如桿狀病毒)、原核系統(例如大腸桿菌)、酵母(例如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母)、哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢，hek293)、植物(例如紅花)、禽類細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞及無細胞系統(例如兔網織紅血球裂解物)。
29、本專利技術第本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種重組蛋白內毒素的去除方法，其特征在于，所述去除方法包括：
2.根據權利要求1所述的去除方法，其特征在于，所述步驟2)中親和層析的操作包括：通過FC洗脫緩沖液沖洗3倍柱體積，然后通過FC平衡緩沖液沖洗層析柱至UV280nm和電導率穩定，將收集到的細胞蛋白表達濃縮液上樣到層析柱，再通過FC平衡緩沖液沖洗層析柱至UV280nm回歸基線，之后依次通過FC淋洗液1、FC淋洗液2以及FC洗脫緩沖液洗脫，UV280nm≥10mAU時開始收集，UV280nm≥10mAU時結束收集；
3.根據權利要求2所述的去除方法，其特征在于，所述FC平衡緩沖液組分為：20mMTris，0.15M?NaCl，6M?HCl；
4.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括權利要求1-3任一項所述的去除方法中使用的試劑。
5.一種低內毒素的重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白由權利要求1-3任一項所述的去除方法制備而成。
6.一種內毒素去除試劑盒，其特征在于，所述內毒素去除試劑盒包括權利要求4所述的組合物，和容器；
7.權利要求1-3任一項所
8.一種系統或裝置，其特征在于，所述系統或裝置包括儲存有權利要求1-3任一項所述的去除方法的計算機存儲介質；
9.權利要求1-3任一項所述的去除方法，權利要求4所述的組合物，權利要求6所述的內毒素去除試劑盒在制備低內毒素水平、高蛋白水平的疫苗中的應用。
10.權利要求1-3任一項所述的去除方法，權利要求4所述的組合物，權利要求6所述的內毒素去除試劑盒在降低含內毒素的重組蛋白藥物對受試者的不良反應中的應用；
...【技術特征摘要】
1.一種重組蛋白內毒素的去除方法，其特征在于，所述去除方法包括：
2.根據權利要求1所述的去除方法，其特征在于，所述步驟2)中親和層析的操作包括：通過fc洗脫緩沖液沖洗3倍柱體積，然后通過fc平衡緩沖液沖洗層析柱至uv280nm和電導率穩定，將收集到的細胞蛋白表達濃縮液上樣到層析柱，再通過fc平衡緩沖液沖洗層析柱至uv280nm回歸基線，之后依次通過fc淋洗液1、fc淋洗液2以及fc洗脫緩沖液洗脫，uv280nm≥10mau時開始收集，uv280nm≥10mau時結束收集；
3.根據權利要求2所述的去除方法，其特征在于，所述fc平衡緩沖液組分為：20mmtris，0.15m?nacl，6m?hcl；
4.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括權利要求1-3任一項所述的去除方法中使用的試劑。
5.一種低內毒素的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：閆博宇，孫爽，徐榕，楊露，王康健，
申請(專利權)人：北京同立海源生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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