【技術實現步驟摘要】
：本專利技術屬于基因工程，具體涉及利用釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其構建與應用。
技術介紹
0、
技術介紹
：
1、n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetyl-d-glucosamine)英文名是glcnac，它是一種非常重要的功能性單糖，在酸性條件下可脫去乙酰基轉化為氨基葡萄糖。氨基葡萄糖不僅是甲殼素、殼聚糖、糖蛋白的重要組成成分，研究表明在蛋白聚糖中氨基葡萄糖也起著重要的作用，這些物質都可以由氨基葡萄糖通過一定的氨基化作用獲得。
2、作為一種生理必需物質，氨基葡萄糖在人體結締組織中也有存在，而且是人體軟骨基質中合成蛋白聚糖所必需的重要成分。此外，氨基葡萄糖的硫酸鹽為治療抗風濕性關節炎的原料藥。近年來，由于發現其具有吸收體內產生的自由基、抗衰老、促進減肥、抑菌以及能調節人體內分泌等多種生理功能，故廣泛被用于食品添加劑和保健食品的生產中。乙酰氨基葡萄糖glcnac可以誘導k562細胞向巨噬細胞的方向分化，在作用濃度和作用時間上與傳統的藥物相比有明顯的優勢，而且因其毒副作用較小，因而很可能成為新型細胞分化誘導藥物而應用于臨床。
3、目前，n-乙酰氨基葡萄糖的生產方法主要為甲殼素水解法，通過使用強酸對生物中的甲殼素進行酸解，使其相互連接的β鍵斷裂，從而解離出n-乙酰氨基葡萄糖單體。該方法存在強酸廢液污染環境、水解條件強烈、蝦殼蟹殼來源造成部分人群過敏等缺陷。因此微生物發酵法逐漸成為了生產glcnac的熱點方向。微生物發酵法利用簡單廉價的碳源(如葡萄糖)直接微生物發酵glcnac，不需要任何前
技術實現思路
0、
技術實現思路
：
1、本申請通過對釀酒酵母代謝途徑進行合理改造，并通過增強主要代謝途徑、阻斷分解代謝等代謝工程策略構建n-乙酰氨基葡萄糖釀酒酵母生產菌，實現了利用廉價碳源葡萄糖生產glcnac。本專利技術提供利用釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其構建與應用，并制定了相應的發酵過程控制方案，有良好的工業應用前景。
2、本專利技術技術方案概述如下：
3、本專利技術提供了一株生產glcnac的釀酒酵母基因工程菌，所述基因工程菌以釀酒酵母為宿主。glcnac生物合成途徑的第一步也是限速步驟是由gfa1基因編碼的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶控制的，它與pfk-1、pfk-2、pfk-26、pfk-27競爭果糖-6-磷酸(f-6-p)作為底物，本專利技術選擇組成型啟動子ptef1來進行控制。為進一步促進f-6-p和無機氨生成氨糖-6-磷酸(glcn6p)，使用ptpi1控制的關鍵酶基因gna1進行催化。yqab是一種可以將n-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(glcnac6p)轉化為磷酸的磷酸酶，所以在pfba1控制的酶基因yqab的作用下，來進行此步催化，由此實現對靶基因的控制強化，進而構建glcnac合成通路。同時，為了減少副反應物果糖-2,6-二磷酸的形成，敲除了6-磷酸果糖-2-激酶的編碼基因pfk26和pfk27，實現了釀酒酵母中glcnac的從頭合成。同時為了增加glcnac的產量，在基因組上對關鍵酶基因gfa1、gna1、yqab進行多拷貝表達。為了進一步減少果糖-1,6-二磷酸的形成，后續還對pfk1基因進行了敲除。
4、本專利技術提供的技術方案之一，是一種釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄糖的方法，所述方案是通過在釀酒酵母宿主中過表達谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶編碼基因gfa1、氨基葡萄糖磷酸n-乙酰轉移酶基因gna1以及果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqab實現的；
5、進一步地，還敲除了基因組上的pfk26和pfk27基因；
6、進一步地，對上述gfa1、gna1、yqab基因進行雙拷貝表達；
7、進一步地，還敲除了基因組上的pfk1基因；
8、更進一步地，采用ptef1啟動子來控制gfa1的表達；
9、更進一步地，采用ptpi1啟動子來控制gna1的表達；
10、更進一步地，采用pfba1啟動子來控制yqab的表達；
11、所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶基因gfa1源自釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4741，核苷酸序列如序列表seq?id?no.4所示；
12、所述氨基葡萄糖磷酸n-乙酰轉移酶基因gna1源自釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4741，核苷酸序列如序列表seq?id?no.5所示；
13、所述果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqab源自大腸桿菌(escherichia?coli)w3110，核苷酸序列如序列表seq?id?no.6所示；
14、所述ptef1啟動子的核苷酸序列如序列表seq?id?no.1所示；
15、所述ptpi1啟動子的核苷酸序列如序列表seq?id?no.2所示；
16、所述pfba1啟動子的核苷酸序列如序列表seq?id?no.3所示；
17、優選地，所述基因工程菌以釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)by4741為宿主出發菌株。
18、提供的技術方案之二，是一株生產n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述菌株以釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)by4741為宿主，在基因組上雙拷貝過表達谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶編碼基因gfa1、氨基葡萄糖磷酸n-乙酰轉移酶基因gna1以及果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqab，同時敲除pfk26和pfk27以及pfk1基因。
19、本專利技術還提供上述生產n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌的構建方法，具體如下：
20、本專利技術中采用crispr/cas9介導的基因編輯技術對釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4741進行定向改造，具體包括如下步驟：
21、(1)構建glcnac合成通路。首先在ygr-204c(gene?id:1466463)位點引入由組成型啟動子ptef1控制的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶基因gfa1，在ycl-049c(geneid:850308)位點引入由組成型啟動子ptpi1控制的氨基葡萄糖磷酸n-乙酰轉移酶基因gna1，在ycl-001w(gene?id:850356)位點引入由組成型啟動子pfba1控制的果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqab，敲除葡萄糖的分解代謝途徑相關基因：pfk26(gene?id:854699)、pfk27(gene?id:853984)、pfk1(gene?id:853155)。
22、(2)在構建上述glcnac合成通路的基礎上，在glo1(gene?id:855009)位點增加gfa1的拷貝，在ypr-003c(gene?id:856111)位點增加gn本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種釀酒酵母生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法是通過在釀酒酵母宿主中過表達谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶編碼基因GFA1、氨基葡萄糖磷酸N-乙酰轉移酶基因GNA1以及果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqAB實現的。
2.如權利要求1所述的釀酒酵母生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，還敲除了宿主基因組上的PFK26、PFK27和PFK1基因。
3.如權利要求1所述的釀酒酵母生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，在宿主中對所述GFA1、GNA1、yqAB基因進行雙拷貝表達。
4.如權利要求1所述的釀酒酵母生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，采用PTEF1啟動子來控制GFA1的表達；采用PTPI1啟動子來控制GNA1的表達；采用PFBA1啟動子來控制yqAB的表達；
5.如權利要求1所述的釀酒酵母生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶基因GFA1源自釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)，核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.4所示；
6.
7.一株生產N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述菌株以釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)BY4741為宿主，在基因組上雙拷貝過表達谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶編碼基因GFA1、氨基葡萄糖磷酸N-乙酰轉移酶基因GNA1以及果糖-1-磷酸磷酸酶yqAB，同時敲除PFK26、PFK27和PFK1基因。
8.權利要求7所述基因工程菌在生產N-乙酰氨基葡萄糖中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法是通過在釀酒酵母宿主中過表達谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶編碼基因gfa1、氨基葡萄糖磷酸n-乙酰轉移酶基因gna1以及果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqab實現的。
2.如權利要求1所述的釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，還敲除了宿主基因組上的pfk26、pfk27和pfk1基因。
3.如權利要求1所述的釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，在宿主中對所述gfa1、gna1、yqab基因進行雙拷貝表達。
4.如權利要求1所述的釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，采用ptef1啟動子來控制gfa1的表達；采用ptpi1啟動子來控制gna1的表達；采用pfba1啟動子來控制yqab的表達；
5.如權利要求1所述的釀酒酵母生產n-乙酰氨基葡萄...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬倩，熊雯雯，耿自豪，謝希賢，吳鶴云，李春雨，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。