【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，特別是涉及bnev和bnov?vp1蛋白二聯重組腺病毒疫苗及其制備方法和應用。
技術介紹
1、病毒性腹瀉是犢牛死亡的主要原因，給全球養牛業造成了巨大的經濟損失。牛紐布病毒(bovine?nebovirus，bnev)和牛諾如病毒(bovine?norovirus，bnov)是引起我國犢牛腹瀉的新發病原，可感染犢牛引發厭食、嘔吐、食欲不振、嚴重腹瀉、脫水及腸道損傷等臨床癥狀。2017年，本實驗室首次在我國四川、河北等省的牦牛和奶牛腹瀉糞便樣本中檢出bnev和bnov，證實這兩種病毒已在我國廣泛流行。然而，目前并沒有針對這兩種病毒開發的疫苗或藥物。因此，加快對安全高效新型基因工程疫苗的研發，對防控bnev和bnov具有重要的意義。
2、bnev和bnov屬于杯狀病毒科(caliciviruses)，是無囊膜的單股正鏈rna病毒，病毒粒子呈近球形，核衣殼呈二十面體對稱。bnev分為3種基因型，基因1型進而分為4個譜系(1～4)，其中基因1.1型為國內流行優勢基因型。bnov分為基因iii.1和基因iii.2兩種基因型，其中基因iii.2為國內流行優勢基因型。vp1蛋白是bnev和bnov的主要結構蛋白，主要參與受體結合、宿主特異性和免疫原性，能誘導產生中和抗體，在病毒的感染免疫中發揮著重要作用。研究表明vp1是開發杯狀病毒亞單位疫苗的重要抗原靶位點。
3、人5型腺病毒載體(ad5)是目前常用的疫苗載體之一，具有宿主廣、表達量高、病毒顆粒穩定、制成重組腺病毒可誘導機體產生強烈特異性體液、細胞和
4、若能以ad5為載體開發出一種有效且高效的bnev和bnov二聯重組腺病毒疫苗對于bnev和bnov的防治具有極為重要的意義。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中存在的問題，本專利技術的目的在于提供bnev和bnov?vp1蛋白二聯重組腺病毒疫苗及其制備方法和應用。
2、第一方面，本專利技術提供一種二聯重組腺病毒穿梭質粒，包括所述vp1基因重組腺病毒穿梭質粒搭載有bnev和bnov的vp1結構蛋白基因；
3、所述bnev的vp1結構蛋白基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；
4、所述bnov的vp1的結構蛋白基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
5、在本專利技術的一些實施例中，所述bnev-vp1為基因1.1型；所述bnov-vp1為基因ⅲ.2型。
6、在本專利技術的一些實施例中，所述二聯重組腺病毒穿梭質粒的載體為pdc316。
7、第二方面，本專利技術提供一種二聯重組腺病毒，包括前述二聯重組腺病毒穿梭質粒與來源于admax腺病毒系統的骨架質粒一起轉染入宿主細胞hek293后獲得。。
8、第三方面，本專利技術提供了前述二聯重組腺病毒在制備預防和/或治療牛紐布病毒和牛諾如病毒藥物和/或疫苗中的應用。
9、本專利技術中，所述藥物和/或疫苗的劑型包括但不限于注射劑、口服劑、滴鼻劑或噴霧劑。第四方面，本專利技術提供一種二聯重組腺病毒的制備方法，包括：
10、(1)優化bnev和bnov的vp1結構蛋白基因；
11、(2)將步驟(1)獲得的bnev的vp1結構蛋白基因和bnov的vp1結構蛋白基因合成并連接到載體，得到重組穿梭質粒pdc316-bnov-bnev；
12、(3)將步驟(2)獲得的pdc316-bnov-bnev與腺病毒骨架質粒pbhglox(delta)e1，3cre共轉染哺乳動物細胞，重組并包裝獲得二聯重組腺病毒rad5-bnov-bnev；
13、(4)對步驟(3)獲得的重組腺病毒進行純化。
14、在本專利技術的一些實施例中，所述哺乳動物細胞為hek293細胞。
15、在本專利技術的一些實施例中，步驟(4)所述純化方法為層析純化，所用介質為diamond?layer?700ba和diamond?q?mustang。
16、第五方面，本專利技術提供一種藥物組合物，包括：前述bnev和/或bnov的vp1結構蛋白基因。
17、所述藥物組合物還可以包括藥學上可接受的佐劑和/或輔料。
18、輔料是指生產藥物組合物和調配處方時所用的賦形劑和附加劑，具有賦形、保護活性成分、提高穩定性、增溶、助溶、緩控釋等重要功能，以使藥物組合物達到一定的保質期和生物利用度，從而提高藥物組合物的安全性和有效性。可與本專利技術申請的藥物組合物共同施用的輔料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。
19、本專利技術具有如下有益效果：
20、(1)本專利技術首次構建并制備出針對基因1.1型bnev?vp1蛋白全長及基因ⅲ.2型bnovvp1蛋白全長的二聯重組腺病毒rad5-bnov-bnev；
21、(2)本專利技術制備得到的rad5-bnov-bnev能夠通過肌肉注射及口服兩種免疫途徑誘導免疫小鼠產生針對bnev?vp1和bnov?vp1蛋白有效的體液免疫和細胞免疫反應，肌肉注射的免疫效果更好；
22、(3)本專利技術制備得到的rad5-bnov-bnev能夠通過肌肉注射免疫途徑誘導免疫犢牛產生針對bnevvp1和bnovvp1蛋白有效的體液免疫反應。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種BNeV和BNoV二聯重組腺病毒穿梭質粒，其特征在于，所述二聯重組腺病毒穿梭質粒搭載有BNeV和BNoV的VP1結構蛋白基因；
2.根據權利要求1所述的二聯重組腺病毒穿梭質粒，其特征在于，所述BNeV為基因1.1型；所述BNoV為基因Ⅲ.2型。
3.根據權利要求1所述的二聯重組腺病毒穿梭質粒，其特征在于，所述二聯重組腺病毒穿梭質粒的載體為pDC316。
4.一種二聯重組腺病毒，其特征在于，其由權利要求1所述的二聯重組腺病毒穿梭質粒與來源于AdMax腺病毒系統的骨架質粒一起轉染入宿主細胞HEK293后獲得。
5.權利要求4所述二聯重組腺病毒在制備預防和/或治療牛紐布病毒和牛諾如病毒藥物和/或疫苗中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述藥物和/或疫苗的劑型為注射劑、口服劑、滴鼻劑或噴霧劑。
7.權利要求4所述二聯重組腺病毒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞為HEK293細胞。
9.根據權利要求7所述的
10.一種藥物組合物，其特征在于，包括權利要求1所述BNeV和/或BNoV的VP1結構蛋白基因。
...【技術特征摘要】
1.一種bnev和bnov二聯重組腺病毒穿梭質粒，其特征在于，所述二聯重組腺病毒穿梭質粒搭載有bnev和bnov的vp1結構蛋白基因；
2.根據權利要求1所述的二聯重組腺病毒穿梭質粒，其特征在于，所述bnev為基因1.1型；所述bnov為基因ⅲ.2型。
3.根據權利要求1所述的二聯重組腺病毒穿梭質粒，其特征在于，所述二聯重組腺病毒穿梭質粒的載體為pdc316。
4.一種二聯重組腺病毒，其特征在于，其由權利要求1所述的二聯重組腺病毒穿梭質粒與來源于admax腺病毒系統的骨架質粒一起轉染入宿主細胞hek293后獲得。
5.權利要求4所述二聯重組腺病毒在制備預防和/或治療牛紐...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳錦波，張斌，陳濤云，湯承，岳華，陳曦，王遠微，高立，
申請(專利權)人：西南民族大學，
類型：發明
國別省市：
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