【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物基因工程，具體涉及一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法。
技術介紹
1、多年前，人類就開始利用酵母來制作發酵產品。如今酵母的應用不僅局限于傳統的發酵領域，還涉及到生物醫藥、生物能源、生物材料等新興的生物制造領域。利用基因工程和合成生物學等技術，人們可以改造或優化酵母的代謝途徑，使其能夠合成多種有價值的代謝產物，從而將酵母轉化為高效、安全、可控的生物合成平臺，即生物工廠。畢赤酵母(pichiapastoris)具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能，且具有高效的蛋白外泌表達能力，是優秀的生物工廠之一。
2、酵母的遺傳操作方便。同源重組是一種精確的修復機制，在釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中非常有效。通過供體片段的不同設計可以分別實現基因的插入、刪除及替換，是外源基因整合入基因組及基因組定向改造的主要手段。但大多數其他酵母物種如畢赤酵母(p.pastoris)傾向于非同源末端連接修復途徑而非同源重組，非同源末端連接過程會隨機引入堿基的插入、突變和缺失，其修復效果難以預測和控制。增強同源重組或消除非同源末端連接可能是改善同源整合的前進方向，可以提高編輯效率。研究發現，敲除參與非同源末端連接的關鍵基因ku70可以有效阻斷非同源末端連接的發生，從而顯著提高基因組的精準編輯效率。
3、此外，現有的基因敲除技術大多是利用篩選標記基因替換掉待敲除基因這種方法進行目的基因的敲除及敲除菌株的篩選，遺留的篩選標記可能會對酵母的生
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法，解決以下技術問題：現有的基因敲除技術大多是利用篩選標記基因替換掉待敲除基因這種方法進行目的基因的敲除及敲除菌株的篩選，遺留的篩選標記可能會對酵母的生長造成不利影響。且由于酵母中篩選標記是有限的，不能回收的篩選標記也將會限制酵母接受基因改造的次數。
2、本專利技術的目的可以通過以下技術方案實現：
3、一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法，包括以下步驟：
4、s1、從畢赤酵母gs115基因組中分別擴增目的基因ku70的上游1000bp序列p1、下游1000bp序列p3；
5、s2、從質粒ppicza-zeo-cre中擴增zeo抗性及cre重組酶序列p2；
6、s3、通過融合pcr將3片段p1、p2及p3整合到一起，p1及p2的重疊融合部分構成了lox71位點，p2及p3的重疊融合部分構成了lox66位點；
7、s4、將融合片段通過電轉化的方法導入畢赤酵母gs115中；
8、s5、通過zeo抗性篩選轉化子，pcr驗證轉化子是否整合到正確的位置；
9、s6、甲醇誘導正確轉化子中cre重組酶的瞬時表達，啟動lox位點間的重組；
10、s7、表型篩選后通過pcr驗證zeo抗性篩選標記及cre重組酶序列是否正確切除。
11、作為本專利技術進一步的方案：步驟s3中，pcr結束后進行瓊脂糖電泳檢測，條帶大小驗證正確后使用gel?dna?extraction?minikit進行產物的純化回收，回收產物記為p123。
12、作為本專利技術進一步的方案：步驟s4中具體步驟為：
13、1)取80μl畢赤酵母gs115感受態細胞，加入6μg融合片段p123，混勻后轉移到預冷的0.2cm電擊杯中；
14、2)冰上放置5min；
15、3)根據對酵母電擊參數設置，電擊；其中參數設為1.5kv，25uf，200ω；
16、4)立即加入2ml預冷的1msorbitol+hepes；具體為10ml1msorbitol+100ul2mhepes，ph＝8.0，轉移至2ml無菌離心管中；
17、5)30℃靜置孵育1-2h；
18、6)取300μl孵育后菌液涂布于含有zeo抗性的ypd平板上，30℃培養至長出克隆。
19、作為本專利技術進一步的方案：步驟s5中，采用3對引物驗證轉化子是否正確整合；其中ku70-f及ku70-r用于驗證ku70基因；yz-f1及yz-r2根據融合片段p123之外的染色體dna設計；yz-r1及yz-f2根據融合片段p123內部序列設計；
20、只有當轉化子同時具備：ku70-f及ku70-r擴增ku70基因無條帶、yz-f1及yz-r1可擴增到正確大小的片段2677bp、yz-f2及yz-r2可擴增到正確大小的片段3230bp這3個條件時，才可說明轉化子中融合片段成功替換掉了ku70基因，并且整合到了正確的位置。
21、作為本專利技術進一步的方案：步驟s6融合片段中，cre重組酶之前的序列中包含aox1啟動子，可在甲醇存在的條件下啟動下游基因即cre重組酶基因的表達；當cre重組酶存在時，lox71位點和lox66位點之間可以發生重組，從而切除兩個位點間的dna序列，達到回收zeo抗性篩選標記及cre重組酶序列的目的；具體操作如下：
22、1)挑取正確的轉化子，接種于5m?l的ypm液體培養基中，ypm液體培養基為1％酵母提取物、2％蛋白胨和1％甲醇，在30℃，200rpm的條件下過夜培養；
23、2)4000rpm離心5min，棄上清，重懸沉淀涂布于ypd平板上，30℃培養至長出克隆；
24、3)將長出的克隆重懸于無菌水中，調od600＝0.02，點板于含有zeo抗性的ypd平板上，30℃培養3天；
25、4)記錄無法在含有zeo抗性的ypd平板上生長的克隆編號。
26、作為本專利技術進一步的方案：步驟s7中，表型篩選是將篩選出的克隆點板至新的含有zeo抗性的ypd平板上，gs115原始菌株以及誘導前的轉化子也點板至此板上作為對照。
27、作為本專利技術進一步的方案：步驟s7中，將表型篩選平板上的所有克隆進行pcr驗證，引物、體系以及擴增程序同步驟s5。
28、本專利技術的有益效果：
29、本專利技術敲除畢赤酵母中參與非同源末端連接的關鍵基因ku70，通過阻斷非同源末端連接的發生來提高基因組的精準編輯效率。通過誘導cre酶的瞬時表達來回收zeo抗性篩選標記及cre重組酶序列，方便后續繼續進行其他基因的編輯。
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1.一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟S3中，PCR結束后進行瓊脂糖電泳檢測，條帶大小驗證正確后使用GelDNAExtractionMiniKit進行產物的純化回收，回收產物記為P123。
3.根據權利要求2所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟S4中具體步驟為：
4.根據權利要求1所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟S5中，采用3對引物驗證轉化子是否正確整合；其中ku70-F及ku70-R用于驗證ku70基因；YZ-F1及YZ-R2根據融合片段P123之外的染色體DNA設計；YZ-R1及YZ-F2根據融合片段P123內部序列設計；
5.根據權利要求1所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟S6融合片段中，cre重組酶之前的序列中包含AOX1啟動子，可在甲醇存在的條件下啟動下游基因即cre重組酶基因的
6.根據權利要求5所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟S7中，表型篩選是將篩選出的克隆點板至新的含有Zeo抗性的YPD平板上，GS115原始菌株以及誘導前的轉化子也點板至此板上作為對照。
7.根據權利要求1所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟S7中，將表型篩選平板上的所有克隆進行PCR驗證，引物、體系以及擴增程序同步驟S5。
...【技術特征摘要】
1.一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟s3中，pcr結束后進行瓊脂糖電泳檢測，條帶大小驗證正確后使用geldnaextractionminikit進行產物的純化回收，回收產物記為p123。
3.根據權利要求2所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟s4中具體步驟為：
4.根據權利要求1所述的一種利用cre-lox系統構建畢赤酵母菌株的方法,其特征在于，步驟s5中，采用3對引物驗證轉化子是否正確整合；其中ku70-f及ku70-r用于驗證ku70基因；yz-f1及yz-r2根據融合片段p123之外的染色體dna設計；yz-r1及yz-f2根據融合片段p123內部序列設計；
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【專利技術屬性】
技術研發人員：柳曹枝，陳彥羽，
申請(專利權)人：南京瑞源生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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