【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
(一)本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學，具體涉及一種抗人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備方法。
技術(shù)介紹
0、(二)
技術(shù)介紹
1、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver?fatty?acid?binding?protein，l-fabp)，又稱脂肪酸結(jié)合蛋白1，是脂肪酸結(jié)合蛋白家族的重要成員，主要在肝臟、小腸及腎臟等組織中表達。它是一種低分子量的胞漿蛋白，在哺乳動物中廣泛存在，包括小腸、心、腦、骨骼肌等多種細胞內(nèi)。l-fabp的主要功能是調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取和胞內(nèi)運輸，能夠?qū)⒅舅釓募毎ど线\送到細胞內(nèi)部，參與脂肪酸、膽固醇、膽汁酸等的轉(zhuǎn)運過程。
2、l-fabp不僅在脂質(zhì)代謝中起到轉(zhuǎn)運作用，還與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如脂肪肝、肝硬化、肝癌、糖尿病等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，l-fabp不僅在肝臟疾病中有重要作用，還在腎臟疾病、肥胖、糖尿病腎病等多種疾病中發(fā)揮著關鍵作用，特別是在急性腎損傷(aki)的早期檢測中，l-fabp作為一種新發(fā)現(xiàn)的生物標志物，可用于診斷和預測aki的嚴重程度和病因。
3、目前，檢測人尿液或血清中l(wèi)-fabp都采用免疫法，主要方法是酶聯(lián)免疫法(elisa)和免疫分散比濁法，也有采用膠體金試紙條[趙俊平,劉紅劍,何曉紅,等.一種快速定量檢測l-fabp的膠體金試紙,cn2014201176158,2014-03-14]和免疫熒光試紙條[趙俊平,劉紅劍,何曉紅,等.快速定量檢測l-fabp的免疫熒光試紙條及其制備方法,cn2014101417159,2014-04-10]等方法，這些方法都需要
4、目前能提供l-fabp單克隆抗體的公司不多，且存在價格高，純度不佳和特異性不足等問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
0、(三)
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)目的是提供一種抗人l-fabp單克隆抗體的制備方法，本專利技術(shù)用重組大腸桿菌表達的人l-fabp作為抗原，通過雜交瘤技術(shù)制備得到高親和力的l-fabp單克隆抗體，該抗體具有純度高、特異性好的特點，可以用于免疫法檢測人尿液以及血清中l(wèi)-fabp含量，為l-fabp單克隆抗體的生產(chǎn)提供新方法。
2、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供一種抗人l-fabp單克隆抗體的制備方法，所述方法為：以重組大腸桿菌表達的重組人l-fabp作為抗原，免疫balb/c小鼠后，取免疫小鼠的脾細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過篩選，獲得能穩(wěn)定分泌l-fabp抗體的雜交瘤細胞株；將雜交瘤細胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通過辛酸-硫酸銨沉淀法和protein?a親和柱層析法兩步純化獲得高純度l-fabp單克隆抗體。
4、進一步，重組人l-fabp氨基酸序列如seq?id?no:1所示。
5、進一步，所述的能分泌l-fabp單克隆抗體的雜交瘤細胞株按如下步驟獲得：
6、(1)l-fabp免疫balb/c小鼠：初次免疫時，pbs緩沖液配制、濃度為1mg/ml的重組人l-fabp溶液與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化，經(jīng)皮下多點注射6–8周齡雌性balb/c小鼠，免疫原用量為50–100μg/只，相同劑量每間隔2周注射一次，連續(xù)接種3次；最后一次注射2周后，用30–50μl相同濃度的重組人l-fabp溶液，直接注射小鼠脾臟加強免疫一次，獲得l-fabp免疫小鼠；
7、(2)飼養(yǎng)層細胞的制備：處死正常6–8周齡雌性balb/c小鼠，75％酒精浸潤消毒5–10min，用消毒后的剪刀在小鼠后腹部剪個小口，撕開其腹外皮膚，暴露腹膜；用無菌注射器取3–5ml預熱至37℃的無血清imdm培養(yǎng)基注射小鼠腹腔，手指輕輕擠壓腹部2–3次，懸浮腹腔細胞，用注射器回收腹腔液；從小鼠胸骨后輕輕地摘取胸腺，將其用無血清imdm培養(yǎng)基沖洗數(shù)次后，用一個無菌注射器柱塞橡膠頭擠壓研磨，收集液體，并與腹腔液混合，以1000–1500r/min離心5min后，棄上清，用15％(v/v)胎牛血清imdm培養(yǎng)基重懸，細胞濃度1×105–2×105個/ml，作為飼養(yǎng)層細胞；
8、(3)免疫脾細胞的制備：處死經(jīng)步驟(1)免疫后的小鼠，用75％酒精浸潤消毒5–10min，用消毒后的剪刀剪開小鼠腹部，用鑷子和剪刀將脾臟剝離出來，除去脂肪和結(jié)締組織，先用75％酒精洗滌，再用無血清imdm培養(yǎng)基淋洗后，置于篩網(wǎng)上，用無菌注射器的橡膠頭充分研磨，用無血清imdm培養(yǎng)基將脾臟細胞沖洗進入無菌離心管，1000–1500r/min離心5min，棄上清，最后用無血清imdm培養(yǎng)基重懸，并進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×108–2×108個/ml，作為免疫脾細胞；
9、(4)細胞融合：將骨髓瘤細胞sp2/0(pbs緩沖液懸浮，1×107–2×107個/ml)與步驟(3)制備的免疫脾細胞按體積比1:6–1:8的比例充分混勻，1000–1500r/min離心5min，棄上清，離心管倒置并輕輕敲擊底部，盡量除去殘留液，離心管置于37℃水浴中，1–2min內(nèi)緩慢加入已預熱37℃的1ml聚乙二醇-1500(peg-1500)，邊加邊搖晃，加完后及時用已預熱37℃的20–30ml無血清imdm培養(yǎng)基終止融合作用，1000–1500r/min離心5min，棄上清，將沉淀的細胞用hat完全培養(yǎng)基(購自sigma公司)充分懸浮；96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl融合細胞懸液和100μl步驟(2)制備的飼養(yǎng)層細胞(1×105–2×105個/ml)，置于細胞培養(yǎng)箱(37℃、5％co2)培養(yǎng)；
10、(5)陽性雜交瘤細胞的篩選及克隆：用0.05mol/l、ph?9.2–9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液將步驟(1)所用的重組人l-fabp溶液稀釋成1–2μg/ml，50μl/孔加入96孔酶標板，4℃包被過夜后拍干，每孔加入pbs緩沖液配制濃度0.1g/l的牛血清白蛋白(bsa)200μl，4℃封閉過夜后拍干備用；取步驟(4)融合培養(yǎng)后的細胞培養(yǎng)上清50μl/孔加入酶標板，于37℃孵育60min后，0.01mol/l?pbst緩沖液(含0.05％體積分數(shù)的tween-20的pbs緩沖溶液)洗滌并拍干，加入50μl/孔的二抗溶液(辣根過氧化物酶標記羊抗鼠igg)，于37℃孵育30–40min后洗滌并拍干，加入50μl/孔tmb(四甲基聯(lián)苯胺)顯色液放置于37℃避光顯色5min，加入50μl/孔的2mol/l?h2so4水溶液終止反應；測定酶標板各孔的od450值，選擇od450值最高的孔，采用有限稀釋法將孔中的細胞進行克隆化，經(jīng)過兩次亞克隆后，獲得穩(wěn)定分泌l-fabp單克隆抗本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種抗人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述方法為：以重組大腸桿菌表達的重組人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白L-FABP作為抗原，免疫Balb/c小鼠后，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過篩選，獲得能穩(wěn)定分泌L-FABP抗體的雜交瘤細胞株；將雜交瘤細胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通過辛酸-硫酸銨沉淀法和ProteinA親和柱層析法兩步純化獲得高純度L-FABP單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重組人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白L-FABP氨基酸序列如SEQ?ID?No:1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的能分泌L-FABP單克隆抗體的雜交瘤細胞株按如下步驟獲得：
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的利用雜交瘤細胞制備L-FABP單克隆抗體按如下步驟操作：
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)透析袋的截留分子量均為15kDa。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)超濾管截留分子量15kDa。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種抗人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述方法為：以重組大腸桿菌表達的重組人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白l-fabp作為抗原，免疫balb/c小鼠后，取免疫小鼠的脾細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過篩選，獲得能穩(wěn)定分泌l-fabp抗體的雜交瘤細胞株；將雜交瘤細胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通過辛酸-硫酸銨沉淀法和proteina親和柱層析法兩步純化獲得高純度l-fabp單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重組人肝型脂肪酸結(jié)合蛋...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王洋，袁春霖，徐欣，陳婷，崔文榮，陳建澍，梅建鳳，
申請(專利權(quán))人：浙江工業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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