【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及使用酶用于生產寡核苷酸的新型方法，其中所述方法適合用于生產化學修飾的寡核苷酸，諸如在治療中使用的那些。
技術介紹
1、經由亞磷酰胺化學法化學合成寡核苷酸和修飾的寡核苷酸是充分確定的，且幾十年來已經成為合成這些確定序列生物聚合物的選擇方法。所述合成方法通常作為固相合成來運行，其中依次添加各種核苷酸，其中每種核苷酸的添加需要幾個化學步驟的循環來在后續步驟的準備中添加和脫保護生長中的寡核苷酸(“寡聚物”)。在核苷酸的依次添加結束時，將所述寡聚物從固相支持物釋放，發生進一步脫保護，且然后將粗制的寡核苷酸通過柱色譜法進一步純化。
2、盡管該方法可以被視作常規的且可以是自動化的，但是該方法存在幾個缺點，特別當目標是大規模制備寡核苷酸時，如寡核苷酸治療劑所需要的。這些缺點包括、但不限于：
3、1)?在色譜法的應用中固有的實際限制，使它不適合用于純化大量寡核苷酸。色譜法的大規模應用是昂貴的，且由于對柱大小和性能的限制而難以實現。
4、2)?錯誤的數目隨著合成的寡核苷酸的長度而積累。因此，當前方法的線性連續性質導致產率的幾何下降。例如，如果核苷酸添加的每個循環的產率是99%，則20聚體的產率將是83%。
5、3)?使用合成寡核苷酸合成儀和下游純化和分離設備的規模限制：目前，在單個批次中可以生產的產物的最大量是在10?kg的量級。
6、因此，需要減少(或理想地消除)柱色譜法和以非完全依次的方式進行合成以便增加產率。
7、dna聚合酶經常被用于合成用在分子生物學和類
技術實現思路
1、本專利技術提供了用于生產具有至少一個修飾的核苷酸殘基的單鏈寡核苷酸產物的方法，其包括：
2、a)?提供包含產物序列的區段的寡核苷酸的合并物(i)，其中所述產物序列的至少一種區段含有至少一個修飾的核苷酸殘基，且其中每種區段已經通過酶促合成或固相合成產生；
3、b)?提供與所述單鏈寡核苷酸產物的序列互補的模板寡核苷酸(ii)，所述模板具有允許其與所述產物分離并再循環以用于將來的反應中的特性；
4、c)?在允許區段寡核苷酸與所述模板寡核苷酸退火的條件下使(i)和(ii)接觸；
5、d)?通過使用連接酶連接所述區段寡核苷酸以形成所述產物；
6、e)?改變所述條件以使退火的模板和任何雜質寡核苷酸鏈變性，和分離所述雜質；
7、f)?改變所述條件以使所述退火的模板和產物寡核苷酸鏈變性，和分離所述單鏈寡核苷酸產物；和
8、g)?將所述模板寡核苷酸再循環以用于將來的反應中。
9、本專利技術還提供了用于生產雙鏈寡核苷酸產物的方法，其中將通過上述用于生產單鏈寡核苷酸產物的方法生產的兩種互補的單鏈寡核苷酸在允許退火的條件下混合。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.用于生產具有至少一個修飾的核苷酸殘基的單鏈寡核苷酸產物的方法，其包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中通過酶促合成產生一種或多種或所有區段寡核苷酸。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中通過使用單鏈連接酶(ss連接酶)、任選地RNA連接酶產生一種或多種區段寡核苷酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其中用于使用ss連接酶產生區段寡核苷酸的方法包括：
5.根據權利要求4所述的方法，其中通過在步驟(i)中使用ss連接酶將磷酸酯氧中任一個的一個或多個被硫取代的3',5'核苷酸雙磷酸酯添加至單鏈寡核苷酸引物的3'-OH。
6.根據權利要求4或5所述的方法，通過在步驟(i)中使用ss連接酶將3',5'雙硫代磷酸酯、3'-磷酸酯-5'-硫代磷酸酯、3'-硫代磷酸酯-5'-磷酸酯、3',5'雙二硫代磷酸酯、3'-磷酸酯-5'-二硫代磷酸酯或3'-二硫代磷酸酯-5'-磷酸酯連接至單鏈寡核苷酸引物的3'-OH。
7.根據任一前述權利要求所述的方法，其中使用轉移酶產生一種或多種或所有區段寡核苷酸。
8.根據權
9.根據任一前述權利要求所述的方法，其中通過酶促合成產生每種區段，任選地其中通過使用ss連接酶產生每種區段。
10.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述方法是半連續或連續的。
...【技術特征摘要】
1.用于生產具有至少一個修飾的核苷酸殘基的單鏈寡核苷酸產物的方法，其包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中通過酶促合成產生一種或多種或所有區段寡核苷酸。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中通過使用單鏈連接酶(ss連接酶)、任選地rna連接酶產生一種或多種區段寡核苷酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其中用于使用ss連接酶產生區段寡核苷酸的方法包括：
5.根據權利要求4所述的方法，其中通過在步驟(i)中使用ss連接酶將磷酸酯氧中任一個的一個或多個被硫取代的3',5'核苷酸雙磷酸酯添加至單鏈寡核苷酸引物的3'-oh。
6.根據權利要求4或5所述的方法，通過在步驟...
【專利技術屬性】
技術研發人員：A·克拉梅里，D·G·圖，
申請(專利權)人：葛蘭素史克知識產權開發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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