【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子植物育種的植物基因工程技術，涉及aswrky9基因的克隆,表達模式分析及其在提高大蒜愈傷組織蒜氨酸含量中的應用。
技術介紹
1、大蒜（ allium?sativum?l.）是百合科（liliaeeae）蔥屬（allium）植物，半年生草本植物，染色體數目為2n=2x=16。自漢代傳入我國，具有悠久的栽培歷史。據統計，近年來我國的大蒜種植面積在80萬hm2以上，大蒜年產量超過2?000萬噸?大蒜產量及出口量分別占全球總產量的70%和60%以上。在《備急千金要方》等諸多中醫典籍中均有對大蒜醫藥功效的記載，認為大蒜可以用于去濕寒等諸多功效。我國是世界上最大的大蒜種植國和出口國，有一定規模的大蒜種植區達70多個，主要集中在山東、河南、江蘇地區，其中以金鄉、蘭陵、萊蕪、杞縣、中牟、邳州集中度最高，產量最大，形成六大主產區。大蒜依據食用器官不同，產品分為鱗莖、蒜薹、青蒜、蒜黃，具有“植物黃金”之稱，既是重要的調味品蔬菜，又是重要的藥用植物，含有多種營養成分。
2、蒜氨酸(s-烯丙基半胱氨酸亞砜，c6h11no3s，分子質量177.22，是鮮蒜中含量最高的非蛋白類含硫氨基酸(6～14?mg/g鮮重)，占大蒜含硫化合物的90%以上，也存在于加工的蒜片、熟蒜，黑蒜、大蒜提取物等產品中。在加工品中，因加工措施不同蒜氨酸含量各異。蒜氨酸易溶于水、無臭、無揮發性，具有以碳和硫原子為中心的立體化學結構，是在組織受損時產生的藥用和風味化合物的主要來源。蒜氨酸和蒜氨酸酶被封閉在大
3、在對大蒜蒜氨酸合成途徑研究中，有文獻鑒定出一種黃素單加氧酶?asfmo1基因，它負責?s-烯丙基-l-半胱氨酸亞砜生物合成中的?s-氧合反應。asfmo1基因催化s-烯丙基-l-半胱氨酸的立體選擇性?s-氧合，幾乎完全產生s-烯丙基半胱氨酸亞砜，其立體化學性質與大蒜中蒜氨酸的主要天然形式相同（具體內容參看已發表文獻：yoshimoto?n,?et?al.identification?of?a?flavin-containing?s-oxygenating?monooxygenase?involved?inalliin?biosynthesis?in?garlic.?the?plant?journal,?2015,?83:?941–951）。asfmo1催化的?s-氧合反應依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸?（nadph）?和黃素腺嘌呤二核苷酸（fad）?的存在，與其他已知的含黃素單加氧酶一致。asfmo1?首選s-烯丙基-l-半胱氨酸而不是?γ-谷氨酰基-s-烯丙基-l-半胱氨酸作為?s-氧合底物，這表明在大蒜中，蒜苷生物合成中間體的?s-氧合主要發生在去谷氨酰化之后。由于蒜氨酸性質穩定、無刺激性氣味、生物活性高、在體內安全無毒代謝快，因此對蒜氨酸的生物合成、活性及其機理研究成為研究焦點。
4、wrky轉錄因子是植物中最大的轉錄調節因子家族之一，是調節許多植物發育過程的信號網的組成部分。wrky家族成員一般含有非常保守的wrkygkq七肽序列和鋅指基序c2h2(cx4-5cx22-23hx1h)?或?c2hc?(cx7cx23hx1c)。因此，可將其分為3個組(group?ⅰ～ⅲ)，其中group?ⅰ含有2個wrky結構域和c2h2鋅指基序；group?ⅱ含有1個wrky結構域和c2h2鋅指基序，根據系統發育關系又可將group?ⅱ進一步分為5個亞組；group?ⅲ含有1個wrky結構域和c2hc鋅指基序。wrky轉錄因子與靶基因啟動子內的w-box順式元件(t)tgac(c/t)?結合，以此激活或抑制轉錄，進而調控下游基因的表達，在植物調控關鍵次級代謝產物合成以應對各種外界環境脅迫方面發揮著關鍵的作用。因此深刻研究wrky轉錄因子在調控大蒜蒜氨酸的合成方面的調控機理，有利于提高大蒜蒜氨酸含量及大蒜育種及應用研究。
5、在本專利技術的前期研究中，使用邳州紫皮大蒜（pzi）作為實驗材料，種植35天，第二片葉子展開后，經過不同時間（0?h,?3?h,?6?h,?12?h）葉片損傷試驗，使用s-433d氨基酸分析儀對蒜氨酸含量測定后，對12個樣本（每個損傷時間點3個樣本）使用rna-seq技術進行測序，獲得了22個表達差異明顯轉錄因子（具體內容參看已發表文獻：yang?x,?et?al.parallel?analysis?of?global?garlic?gene?expression?and?alliin?contentfollowing?leaf?wounding.?bmc?plant?biology.?2021,?21:174）。使用文獻公開的黃素單氧化酶基因 asfmo1合成引物，獲得了該基因cds?序列。分析靶基因的功能及參與的遺傳調控網絡，最終探討蒜氨酸合成的分子遺傳調控。
技術實現思路
1、專利技術的目的：針對現有培育高品質大蒜的技術存在的問題，本專利技術提供一種能夠提高大蒜中蒜氨酸含量的大蒜aswrky9轉錄因子基因及其應用。
2、本專利技術的第一個方面提供了一種可以提高大蒜蒜氨酸含量的轉錄因子aswrky9，其核苷酸序列如seq?id?no.1序列所示。同時提供了大蒜aswrky9轉錄因子基因的表達蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
3、本專利技術提供了用于pcr擴增權利要求1所述大蒜aswrky9開放閱讀框的引物，其序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
4、本專利技術還提供了一種表達載體，所述表達載體含有權利要求1所述大蒜aswrky9轉錄因子的全部序列或部分片段。
5、進一步的，所述表達載體使含有大蒜aswrky9轉錄因子的植物雙元表達載體。
6、本專利權利要求1所述了大蒜蒜氨酸合成酶asfmo1基因啟動子如seq?id?no.5所示，本專利從分子調控機制上證實了aswrky9轉錄因子能正向調控大蒜蒜氨酸合成酶asfmo1基因，進而調控蒜氨酸的合成。
7、本專利技術還提供一種轉基因細胞系，所述轉基因細胞系含有權利要求1所述大蒜aswrky9轉錄因子的全部序列或部分片段。
8、本專利技術第二個方面是提供上述大蒜aswrky9轉錄因子在提高大蒜蒜氨酸含量中的應用。
9、進一步的，所述應用是提高大蒜愈傷組織蒜氨酸的合成能力。
10、本專利技術還提供了一種生產高品質大蒜的方法，在轉基因大蒜中表達權利要求1所示大蒜aswrky9轉錄因子。
11、相比本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種能夠提高大蒜蒜氨酸含量的轉錄因子基因AsWRKY9，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.權利要求1所述的轉錄因子基因AsWRKY9的表達蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQID?NO.2所示。
3.一種克隆權利要求1所述的轉錄因子基因AsWRKY9的PCR引物對，其特征在于，序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。
4.?權利要求1所述的轉錄因子基因AsWRKY9正向調控大蒜蒜氨酸合成酶AsFMO1基因，大蒜蒜氨酸合成酶AsFMO1基因的啟動子如SEQ?ID?NO.5所示。
5.大蒜轉錄因子AsWRKY9在提高大蒜愈傷中蒜氨酸含量的應用，其特征在于：包括如權利要求1所述的核苷酸序列。
6.一種能高效獲取高表達蒜氨酸大蒜的方法，其特征在于，構建AsWRKY9轉錄因子基因的植物雙元表達載體，轉化到大蒜愈傷組織中。
7.一種生產高品質大蒜的方法，其特征在于，在轉基因大蒜中表達權利要求1所示大蒜AsWRKY9轉錄因子。
【技術特征摘要】
1.一種能夠提高大蒜蒜氨酸含量的轉錄因子基因aswrky9，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.權利要求1所述的轉錄因子基因aswrky9的表達蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seqid?no.2所示。
3.一種克隆權利要求1所述的轉錄因子基因aswrky9的pcr引物對，其特征在于，序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。
4.?權利要求1所述的轉錄因子基因aswrky9正向調控大蒜蒜氨酸合成...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊緒勤，吳家瑩，李敏，蘇奕人，孟憲鋒，楊艷艷，王婉妮，曾麗梅，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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