【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及新型啟動(dòng)子變異體等，更詳細(xì)地，涉及能夠組成型地高水平表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的新型啟動(dòng)子變異體及其多種用途。
技術(shù)介紹
1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，查明了多種調(diào)節(jié)基因的表達(dá)的機(jī)制?；虻谋磉_(dá)是指通過在細(xì)胞中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄(transcription)及翻譯(translation)并根據(jù)輸入到基因中的密碼來合成蛋白質(zhì)的一系列過程。尤其，轉(zhuǎn)錄過程作為基因表達(dá)的初期階段，通過核糖核酸(rna)聚合酶在多種輔助因子的幫助下與存在于基因的上游的啟動(dòng)子(promoter)序列結(jié)合來開始，轉(zhuǎn)錄因子(tf，transcription?factor)為上述輔助因子中的一種，已知與啟動(dòng)子序列直接結(jié)合。尤其在原核生物中，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄階段發(fā)生，不斷有新的轉(zhuǎn)錄因子及啟動(dòng)子被研究人員發(fā)現(xiàn)。
2、產(chǎn)業(yè)上為了生產(chǎn)酶等外源性蛋白質(zhì)，主要使用通過由包含外源性蛋白質(zhì)基因pet型的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌等原核生物來制備的轉(zhuǎn)化體作為表達(dá)系統(tǒng)。由pet型的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核生物表達(dá)系統(tǒng)通常需要異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside)等昂貴的表達(dá)誘導(dǎo)劑(inducer)，具有需要細(xì)微地調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑濃度或設(shè)備、表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)間等的缺點(diǎn)。
3、另一方面，為了大量生產(chǎn)具有將果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖(allulose或psicose)的活性的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，提出了將作為普遍認(rèn)為安全的(gras，generally?recognizedas?safe)菌株的棒狀桿菌屬菌株用作宿主細(xì)胞的
4、因此，為了大量生產(chǎn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶或利用阿洛酮糖差向異構(gòu)酶從果糖大量生產(chǎn)阿洛酮糖，不僅是將棒狀桿菌用作宿主細(xì)胞的情況，還需要開發(fā)在大腸桿菌宿主細(xì)胞的通常培養(yǎng)條件下不受生長抑制地穩(wěn)定且高水平地表達(dá)外源性蛋白質(zhì)的組成型表達(dá)啟動(dòng)子及包含其的組成型表達(dá)系統(tǒng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、技術(shù)問題
2、本專利技術(shù)在以往的技術(shù)背景下導(dǎo)出，本專利技術(shù)的目的在于，提供能夠組成型地高水平地表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的新型啟動(dòng)子變異體。并且，本專利技術(shù)的目的在于，提供上述新型啟動(dòng)子變異體的多種用途。
3、技術(shù)方案
4、本專利技術(shù)的專利技術(shù)人將作為用于表達(dá)大腸桿菌(escherichia?coli)的tata(雙精氨酸轉(zhuǎn)位酶a(twin?arginine?translocase?a))基因的啟動(dòng)子的tata基因啟動(dòng)子與編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸可操作地連接來制備重組表達(dá)載體并將其導(dǎo)入大腸桿菌來轉(zhuǎn)化。在此情況下，在tata啟動(dòng)子或阿洛酮糖差向異構(gòu)酶基因序列中發(fā)生隨機(jī)變異，本專利技術(shù)的專利技術(shù)人從而獲得由多種重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌。在通過上述隨機(jī)變異獲得的重組表達(dá)載體中，比較由阿洛酮糖差向異構(gòu)酶基因序列中不發(fā)生變異而僅在tata基因啟動(dòng)子中發(fā)生變異的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶活性的結(jié)果，確認(rèn)到tata基因啟動(dòng)子的堿基序列中作為第160個(gè)核苷酸的胸腺嘧啶(t)后附加胞嘧啶(c)的啟動(dòng)子變異體或tata基因啟動(dòng)子的堿基序列中作為第146個(gè)核苷酸的胞嘧啶(c)被鳥嘌呤(g)取代，作為第148個(gè)核苷酸的胞嘧啶(c)被腺嘌呤(a)取代，作為149個(gè)核苷酸的腺嘌呤(a)被鳥嘌呤(g)取代，作為第159個(gè)核苷酸及第160個(gè)核苷酸的鳥嘌呤(g)及胸腺嘧啶(t)缺失的啟動(dòng)子變異體能夠組成型地高水平表達(dá)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，從而完成本專利技術(shù)。
5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)的一例提供由序列9的堿基序列或序列10的堿基序列構(gòu)成的變異體。并且，本專利技術(shù)的一例提供包含由序列9的堿基序列或序列10的堿基序列構(gòu)成的啟動(dòng)子變異體的重組載體。并且，本專利技術(shù)的一例提供包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸及與其可操作地連接的由序列9的堿基序列或序列10的堿基序列構(gòu)成的啟動(dòng)子變異體的表達(dá)載體。并且，本專利技術(shù)的一例提供由上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組菌株。并且，本專利技術(shù)的一例提供利用上述重組菌株來生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。并且，本專利技術(shù)的優(yōu)選一例提供從底物制備酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括向含底物溶液加入上述重組菌株并進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的步驟。
6、專利技術(shù)的效果
7、本專利技術(shù)的新型啟動(dòng)子變異體可以組成型地高水平表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)，尤其可以在大腸桿菌中組成型地高水平表達(dá)酶。因此，在利用由包含本專利技術(shù)的新型啟動(dòng)子變異體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組菌株的情況下，可以經(jīng)濟(jì)地大量生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)，尤其是酶。例如，在利用由包含本專利技術(shù)的新型啟動(dòng)子變異體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組菌株的情況下，可以經(jīng)濟(jì)地大量生產(chǎn)阿洛酮糖差向異構(gòu)酶或從果糖經(jīng)濟(jì)地大量生產(chǎn)阿洛酮糖。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種啟動(dòng)子變異體，其特征在于，由序列9的堿基序列或序列10的堿基序列構(gòu)成。
2.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子變體。
3.一種表達(dá)載體，其特征在于，包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸以及與其可操作地連接的權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子變異體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，上述目標(biāo)蛋白質(zhì)為酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，上述酶為阿洛酮糖差向異構(gòu)酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，上述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶由序列3的氨基酸序列、序列5的氨基酸序列或序列7的氨基酸序列構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，編碼上述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸由序列4的堿基序列、序列6的堿基序列或序列8的堿基序列構(gòu)成。
8.一種重組菌株，其特征在于，由權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而來。
9.一種從果糖制備阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括向含果糖溶液中加入權(quán)利要求8所述的重組菌株并反應(yīng)的步驟。
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
1.一種啟動(dòng)子變異體，其特征在于，由序列9的堿基序列或序列10的堿基序列構(gòu)成。
2.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子變體。
3.一種表達(dá)載體，其特征在于，包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸以及與其可操作地連接的權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子變異體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，上述目標(biāo)蛋白質(zhì)為酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，上述酶為阿洛酮糖差向異構(gòu)酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：崔銀碩，李芝河，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：大象株式會(huì)社，
類型：發(fā)明
國別省市：
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