【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥技術(shù)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種人類(lèi)胰腺癌相關(guān)的血清microrna標(biāo)志物及一種新的胰腺癌診斷方法。
技術(shù)介紹
1、在消化系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤中，胰腺癌的惡性程度較高，患者5年生存率不足8%，有“癌癥之王”之稱(chēng)。臨床診斷困難，中位生存期短，預(yù)后差為顯著特點(diǎn)。
2、胰腺癌早期診斷十分困難，主要治療手段包括手術(shù)與放化療，傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物在胰腺癌診斷及靶標(biāo)治療上未能取得較好的效果。因此，尋找新的生物標(biāo)志物對(duì)于胰腺癌的早期診斷及治療非常重要。
3、微小核糖核酸（microrna，mirna）是一類(lèi)長(zhǎng)度很短的非編碼單鏈小分子rna，長(zhǎng)度約為19~23nt，由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為70~80個(gè)核酸的mirna前體剪切后生成，能夠通過(guò)與靶mrna特異性的堿基配對(duì)引起靶mrna的降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控。雖然目前胰腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但近年來(lái)已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)microrna在胰腺癌中異常表達(dá)，并參與胰腺癌的生物調(diào)控，發(fā)揮致癌或抑癌基因的作用，有望成為新的生物標(biāo)志物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供一組胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物及胰腺癌診斷方法，提供的胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物在胰腺癌早期、中期和晚期（ⅰ期、ⅱ期和ⅲ期）都具有較高的診斷準(zhǔn)確度，針對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)提出的胰腺癌microrna標(biāo)志組合進(jìn)行胰腺癌檢測(cè)，可對(duì)是否患有胰腺癌做出準(zhǔn)確判斷，進(jìn)一步提高胰腺癌診斷效果，提升診斷價(jià)值。p>
2、為實(shí)現(xiàn)專(zhuān)利技術(shù)目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：
3、本專(zhuān)利技術(shù)提供了胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物由hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764構(gòu)成；其中：hsa-mir-125的序列為tccctgagaccctttaacctgtga，hsa-mir-155的序列為ttaatgctaatcgtgataggggtt，hsa-mir-21的序列為tagcttatcagactgatgttga，hsa-mir-31的序列為aggcaagatgctggcata，hsa-mir-3683的序列為tgcgacattggaagtagtatca，hsa-mir-4764的序列為tggatgtggaaggagttatct。
4、本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種胰腺癌診斷方法，其特征在于，包括如下步驟：
5、s1.?抽取被檢測(cè)人員的外周血放入分離膠采血管中，經(jīng)離心處理后得到外周血血清，經(jīng)過(guò)抽提純化后，得到含有總rna的待測(cè)血清樣本；
6、s2.?用real-time?pcr方法檢測(cè)待測(cè)血清樣本中胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764在血清中的相對(duì)表達(dá)量；real-time?pcr檢測(cè)使用的pcr檢測(cè)試劑中含有針對(duì)上述胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物的引物；
7、s3.?將步驟s2測(cè)出的δct值輸入如下判別公式：
8、綜合判斷值=-3.513+0.042*δct?hsa-mir-125?+0.449*δct?hsa-mir-155?-0.774*δct?hsa-mir-21?+0.159*δct?hsa-mir-31?-0.539*δct?hsa-mir-3683?+0.751*δct?hsa-mir-4764；綜合判斷值≥0時(shí)，為陽(yáng)性，患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較高；綜合判斷值＜0時(shí)，為陰性，患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較低。
9、所述pcr檢測(cè)試劑中含有的引物具體如下：標(biāo)志物hsa-mir-125（seq?id?no.1）的上游引物hsa-mir-125-f的序列為tccctgagaccctttaacctg（seq?id?no.7）；標(biāo)志物hsa-mir-155（seq?id?no.2）的上游引物hsa-mir-155-f的序列為ttaatgctaatcgtgatagg（seqid?no.8）；標(biāo)志物hsa-mir-21（seq?id?no.3）的上游引物hsa-mir-21-f的序列為tagcttatcagactgatgt（seq?id?no.9）；標(biāo)志物hsa-mir-31（seq?id?no.4）的上游引物hsa-mir-31-f的序列為aggcaagatgctggcata（seq?id?no.10）；標(biāo)志物hsa-mir-3683（seq?idno.5）的上游引物hsa-mir-3683-f的序列為tgcgacattggaagtagtat（seq?id?no.11）；標(biāo)志物hsa-mir-4764（seq?id?no.6）的上游引物hsa-mir-4764-f的序列為tggatgtggaaggagtta（seq?id?no.12）；上述6個(gè)標(biāo)志物的通用下游引物universal?rp的序列為cagtgcagggtccgaggt（seq?id?no.13）。
10、為了方便臨床檢測(cè)使用，可以將在本專(zhuān)利技術(shù)胰腺癌診斷方法步驟s2中使用的pcr檢測(cè)試劑和工具制備成試劑盒，所述pcr檢測(cè)試劑可以由含有針對(duì)胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物（hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764）的引物試劑，以及陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、taq酶、dntps、pcr緩沖液、mgcl、tagman探針、熒光定量pcr參比染料等試劑構(gòu)成，其中，含有引物的試劑是針對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)胰腺癌標(biāo)志物而特別設(shè)計(jì)的，其他試劑均可采用現(xiàn)有技術(shù)中相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的常用試劑。
11、為了評(píng)估本專(zhuān)利技術(shù)胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物組合（即hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764組合）診斷胰腺癌的效果，本專(zhuān)利技術(shù)人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（sop）采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，建立完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，并采用了rt-pcr方法、taqman?mirna?array、real-time?pcr（taqman探針）方法的多種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
12、具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法包括以下幾個(gè)部分：
13、第一部分、研究對(duì)象選擇和分組依據(jù)
14、a組：對(duì)照組（n=120，90例健康對(duì)照者，30例非胰腺腫瘤患者），無(wú)其他全身性重大疾病；
15、b組：胰腺癌患者（n=150），無(wú)其他全身性重大疾病。
16、第二部分、制備待測(cè)血清樣本
17、（1）抽取被檢測(cè)人員的外周血（2ml）放入分離膠采血管中，將分離膠采血管180°上下顛倒混勻，12小時(shí)內(nèi)，將分離膠采血管在3,000×g條件下離心10分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中得到待檢測(cè)外周血血清，在-本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.胰腺癌相關(guān)血清microRNA標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物由hsa-miR-125、hsa-miR-155、hsa-miR-21、hsa-miR-31、hsa-miR-3683和hsa-miR-4764構(gòu)成；其中：hsa-miR-125的序列為tccctgagaccctttaacctgtga，hsa-miR-155的序列為ttaatgctaatcgtgataggggtt，hsa-miR-21的序列為tagcttatcagactgatgttga，hsa-miR-31的序列為aggcaagatgctggcata，hsa-miR-3683的序列為tgcgacattggaagtagtatca，hsa-miR-4764的序列為tggatgtggaaggagttatct。
2.一種胰腺癌診斷方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種胰腺癌診斷方法，其特征在于，所述PCR檢測(cè)試劑中含有的引物具體如下：標(biāo)志物hsa-miR-125（SEQ?ID?No.1）的上游引物hsa-miR-125-F的序列為tccctgagaccctttaacctg（SE
...【技術(shù)特征摘要】
1.胰腺癌相關(guān)血清microrna標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物由hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764構(gòu)成；其中：hsa-mir-125的序列為tccctgagaccctttaacctgtga，hsa-mir-155的序列為ttaatgctaatcgtgataggggtt，hsa-mir-21的序列為tagcttatcagactgatgttga，hsa-mir-31的序列為aggcaagatgctggcata，hsa-mir-3683的序列為tgcgacattggaagtagtatca，hsa-mir-4764的序列為tggatgtggaaggagttatct。
2.一種胰腺癌診斷方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種胰腺癌診斷方法，其特征在于，所述pcr檢測(cè)試劑中含有的引物具體如下：標(biāo)志物hsa-mir-125（seq?id?no.1）的上游引物hsa-mir-125-f的序列為tccctgagaccctttaacctg（seq?id?no.7）；標(biāo)志物hsa-mir-155（seq?...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張炳強(qiáng)，陳夢(mèng)夢(mèng)，林泉，欒延松，于俊梅，周陽(yáng)，孫國(guó)龍，江鑫，韓麗輝，孫允東，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：青島瑞思德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，
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