【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本申請涉及nk細胞，尤其是涉及免疫調(diào)節(jié)劑在制備增強nk細胞毒性作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、自然殺傷（nk）細胞是一種先天淋巴細胞（ilcs），源自于骨髓造血干細胞，早期發(fā)育過程中其抑制性受體與正常靶細胞的表面配體相互識別，從而獲得針對自身細胞的免疫耐受能力，隨后進一步發(fā)育成熟。成熟nk細胞在被激活后，通過死亡受體和細胞毒性顆粒等方式發(fā)揮針對病毒感染、腫瘤細胞的殺傷作用。
2、nk細胞殺傷作用的激活由抑制性受體和激活性受體聯(lián)合介導。抑制性受體包括kir2dl、kir3dl、cd94/nag2a、cd94/nag2b、ilt2等，激活性受體包括kir2ds、kir3ds、cd94/nag2c、cd94/nag2e、nkg2d、天然細胞毒性受體（ncrs）、cd16等。例如cd16（fcγriiia）這種fc受體負責誘導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性（adcc），而ncrs和nkg2d可刺激nk細胞對受感染和轉(zhuǎn)化細胞的細胞毒性。
3、nk細胞在當前的腫瘤免疫治療研究中具有重要的地位，對t細胞免疫治療具有互補和促進作用，其優(yōu)勢還體現(xiàn)在可以作為通用型合成免疫細胞療法的底盤細胞。然而，在腫瘤微環(huán)境中，nk細胞會受到一系列負向調(diào)控，進入功能低下的“免疫耗竭”狀態(tài)，典型特征包括細胞毒性下降、細胞因子分泌減少等。因此，有必要提高nk細胞的細胞毒性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本申請旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本申請?zhí)岢鲆环N免疫調(diào)節(jié)劑在制備增強nk細胞毒性作用
2、本申請的第一方面，提供免疫調(diào)節(jié)劑在制備增強nk細胞毒性作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述免疫調(diào)節(jié)劑包括motolimod。
3、其中，motolimod（莫托莫德，cas號：926927-61-9，分子式c28h34n4o2）是一種選擇性且有效的toll-like?receptor?8（tlr8）免疫調(diào)節(jié)劑，對適應(yīng)性和先天性免疫反應(yīng)都有生物學免疫活性，能免疫刺激增強免疫細胞活性和免疫功能?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)motolimod對于外周血單個核細胞（pbmc）的作用，刺激pbmcs中tnfα和il-12的產(chǎn)生，在單核細胞和mdcs中，通過nf-κb活化選擇性誘導tnfα和il-12產(chǎn)生。但對于其在nk細胞，特別是對于nk細胞毒性作用方面的研究較少。
4、細胞毒性作用是指在抑制靶細胞活力方面的能力，通常包括對于靶細胞的細胞形態(tài)、空泡形成、脫落、溶解、膜完整性等其中至少一個方面的改變，例如使靶細胞死亡、生長繁殖和克隆形成等方面受到抑制。
5、在本申請的一些實施方式中，motolimod的工作濃度為1~100?mmol/l（mm），例如可以是1?mmol/l、2?mmol/l、3?mmol/l、4?mmol/l、5?mmol/l、6?mmol/l、7?mmol/l、8?mmol/l、9mmol/l、10?mmol/l、20?mmol/l、30?mmol/l、40?mmol/l、50?mmol/l、60?mmol/l、70?mmol/l、80?mmol/l、90?mmol/l、100?mmol/l。
6、其中，工作濃度是指實際在與nk細胞混合以增強其細胞毒性作用時所用的濃度。具體在存儲運輸時motolimod可以是更高濃度的溶液形式，而在使用時將其稀釋到合適的工作濃度。可以理解的是，也可以采用干粉等常用的其他形式進行存儲運輸。
7、在本申請的一些實施方式中，增強nk細胞毒性作用包括通過抗體刺激nk細胞增強細胞毒性作用，抗體包括cd56抗體。
8、cd56，又稱神經(jīng)細胞粘附分子（ncam），是屬于細胞粘附分子（cams）ig超家族的一種表面蛋白。根據(jù)cd56的表達情況，nk細胞通?？梢苑譃閏d56bright和更成熟的cd56dim兩個亞群。其中，cd56dim細胞主要表現(xiàn)細胞毒性，表達高水平cd16a，并迅速介導adcc等細胞溶解功能，cd56bright細胞表達低水平cd16a但可以產(chǎn)生大量細胞因子。而在本申請的實施例中發(fā)現(xiàn)，cd56抗體可以在motolimod作用下對nk細胞具有一定的刺激效果，從而增強nk細胞的細胞毒性。
9、在本申請的一些實施方式中，cd56抗體在細胞培養(yǎng)過程中以包被形式附著在細胞培養(yǎng)容器中，而motolimod以溶質(zhì)形式溶于細胞培養(yǎng)過程中所使用的培養(yǎng)基中。通過上述培養(yǎng)過程獲得具有增強細胞毒性作用的nk細胞。
10、在本申請的一些實施方式中，nk細胞的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，添加劑包括上述的motolimod。
11、在本申請的一些實施方式中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基dmem培養(yǎng)基、rpmi?1640培養(yǎng)基、imdm培養(yǎng)基、mem培養(yǎng)基中的任一種?？梢岳斫獾氖牵A(chǔ)培養(yǎng)基也可以是本領(lǐng)域所知的其他適用于nk細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
12、在本申請的一些實施方式中，產(chǎn)品包括細胞培養(yǎng)容器，cd56抗體以1~100?μg/ml的濃度包被于細胞培養(yǎng)容器，例如可以是1?μg/ml、2?μg/ml、3?μg/ml、4?μg/ml、5?μg/ml、6?μg/ml、7?μg/ml、8?μg/ml、9?μg/ml、10?μg/ml、20?μg/ml、30?μg/ml、40?μg/ml、50?μg/ml、60μg/ml、70?μg/ml、80?μg/ml、90?μg/ml、100?μg/ml。
13、其中，抗體是指特異性結(jié)合抗原的免疫球蛋白，具體的，cd56抗體是指能夠特異性結(jié)合cd56表面蛋白的免疫球蛋白。
14、在本申請的一些實施方式中，cd56抗體包括cd56的單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體、多價抗體等其中至少一種。此外，還可以對抗體進行多種修飾，例如peg化、糖基化、形成抗體分子偶聯(lián)物（例如adc）、添加純化標簽、或者與其他蛋白融合等其中至少一種。在本申請的一些實施方式中，cd56抗體還包括cd56的抗原結(jié)合片段，抗原結(jié)合片段包括至少一個或多個cdr片段，例如fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、fc、fd、結(jié)構(gòu)域抗體等。在本申請的一些實施方式中，cd56抗體包括人抗體、人源化抗體或嵌合抗體中的至少一種。
15、在本申請的一些實施方式中，cd56抗體的包被方法包括以下步驟：在細胞培養(yǎng)容器中加入cd56抗體的溶液，孵育，洗滌，干燥，得到預包被cd56抗體的細胞培養(yǎng)容器。
16、在本申請的一些實施方式中，cd56抗體的溶液為cd56抗體的緩沖液，如pbs、hbss、dpbs、ebss等其中任一種。
17、在本申請的一些實施方式中，cd56抗體的孵育時間為0.1~24?h，例如是0.1?h、0.2h、0.3?h、0.5?h、1?h、2?h、3?h、4?h、6?h、8?h、12?h、16?h、20?h、24?h。
18、在本申請的一些實施方式中，cd56抗體的孵育溫度為4~40?℃，例如可以是4?℃、10?℃、15?℃、20?℃、2本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.免疫調(diào)節(jié)劑在制備增強NK細胞毒性作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑包括Motolimod。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Motolimod的工作濃度為1~100?mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述增強NK細胞毒性作用包括通過抗體刺激NK細胞增強細胞毒性作用，所述抗體包括CD56抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括細胞培養(yǎng)容器，所述CD56抗體以1~100?μg/mL的濃度包被于所述細胞培養(yǎng)容器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗體還包括NKG2D抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述NKG2D抗體以1~100?μg/mL的濃度包被于所述細胞培養(yǎng)容器。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，NK細胞為外周血來源的NK細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述增強NK細胞毒性作用包括增強NK細胞的脫顆粒和IFN-γ的分泌中的至少一種。
9.增強NK細胞毒性
10.增強NK細胞毒性作用的NK細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.免疫調(diào)節(jié)劑在制備增強nk細胞毒性作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑包括motolimod。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述motolimod的工作濃度為1~100?mmol/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述增強nk細胞毒性作用包括通過抗體刺激nk細胞增強細胞毒性作用，所述抗體包括cd56抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括細胞培養(yǎng)容器，所述cd56抗體以1~100?μg/ml的濃度包被于所述細胞培養(yǎng)容器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉佳，
申請(專利權(quán))人：深圳市中佳生物醫(yī)療科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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