【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥，具體而言，涉及一種提高il-12治療安全性的工程化mrna及其制備方法和應用。
技術介紹
1、白細胞介素-12(interleukin-12,il12)是一種異源二聚體結構的細胞因子，分別由35kda的輕鏈(也稱p35)和一個40kda(也稱p40)的重鏈通過二硫鍵連接而成的，亞單位p35和p40分別由白細胞介素12a(interleukin12a)和白細胞介素12b(interleukin12b)基因編碼。il-12在細胞免疫應答過程中起到關鍵調節作用，具有重要的生物活性。il12通過nk和t細胞誘導th1細胞分化，促進γ干擾素(interferon-γ,ifn-γ)的產生，下調血管內皮生長因子及程序性死亡配體1等來影響腫瘤的生長、轉移。il-12在固有免疫和獲得免疫之間建立起重要聯系，處于th1免疫過程的中心地位，被認為是最有效的抗腫瘤細胞因子之一，利用il-12進行疾病治療逐步成為研究的熱點。目前有很多利用il-12重組蛋白進行疾病治療的研究，尤其是用于腫瘤的免疫治療。但是重組蛋白療法有其固有的局限性，比如蛋白在體內的半衰期較短，達到理想的治療效果需要進行多次注射，容易導致劑量限制性的全身性不良反應。
2、與注射純化重組蛋白相比，體外轉錄(ivt)mrna是一種理想的治療方法，它具有可編程、半衰期較長、免疫原性較低、制造工藝較簡單和成本較低等優點。mrna技術應用于疾病的治療，已經過10多年的發展演進，展現出極大的應用潛力。mrna療法是利用線性化的質粒dna為模板，通過體外轉錄、加帽反
3、然而現有的il-12mrna療法在體內會產生大量的il-12蛋白，容易導致系統性的免疫不良反應，為避免il-12帶來的免疫不良反應，目前il-12療法基本都采用瘤內注射(局部注射)，而瘤內注射本身的局限在于它只能用于治療能通過醫療手段檢測到的病灶，而無法實現對深層病灶、微小病灶或者遠端轉移病灶等的有效治療。
4、因此，急需設計一種新的mrna，在維持il-12mrna優異抑癌效果的前提下，還可以提高基于il-12的mrna在系統注射療法中的安全性，同時拓寬il-12mrna療法的臨床應用場景。
技術實現思路
1、為解決現有技術中存在的問題，本專利技術提供一種提高il-12治療安全性的工程化mrna及其制備方法和應用，通過以mrna?il-12的結構為基礎，在mrna?il-12的n端連接特異性的p40受體結合域，二者通過一個可以被mmp-2特異性切割的linker連接，構建得到mrnashield-il-12，從而阻礙il-12的生物活性，減少其翻譯產生的蛋白在血液中、健康組織中的免疫不良反應；同時，所述mrna?shield-il-12表達的蛋白可只在mmp-2高表達的部位(腫瘤外基質部位)被mmp-2識別并特異性切割，從而恢復生物活性，與靶細胞結合從而刺激靶細胞釋放炎癥因子，抑制腫瘤生長。
2、為了達到上述目的，本專利技術采用以下方案實現：
3、一方面，本專利技術提供一種提高il-12治療安全性的工程化mrna，所述mrna從n端到c端依次包括受體結合域、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35。
4、在一些實施方式中，本專利技術以最佳制備方法構建得到一種全新的提高il-12治療安全性的工程化mrna，在mrna?il-12結構的基礎上，經過大量對比篩選實驗，最終優化得到mrna?shield-il-12，一方面避免了由于在體內表達大量具有活性的il-12蛋白而導致的系統性免疫不良反應，提高了治療的安全性，可實現腫瘤靶向的活性回復，明顯抑制腫瘤生長；另一方面，安全性的提高突破了目前常用的瘤內注射手段的限制，可通過靜脈注射治療腫瘤，從而實現對深層病灶、微小病灶或者遠端轉移病灶等的有效治療。
5、進一步地，所述受體結合域包括p40受體、p35受體、p19受體或抗p40納米抗體，所述mrna從n端到c端依次包括p40受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35；或從n端到c端依次包括p35受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p35、p40；或從n端到c端依次包括p19受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35；或從n端到c端依次包括抗p40納米抗體、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35。
6、在一些實施方式中，對不同受體對構建的mrna的影響進行了對比測試，實驗結果表明：最終優選在p40上連接p40受體，來構建mrna?shield-il-12，從n端到c端，依次為p40受體、mmp-2響應肽、p40、p35；此時，在維持il-12mrna優異抑癌效果的前提下，可以顯著降低血清中炎癥因子ifnγ和肝臟毒性標志物alt的含量，提高基于il-12的mrna在系統注射療法中的安全性，從而大大提高小鼠的存活期，同時安全性的提高還使得突破了瘤內注射的局限，實現了靜脈注射治療，從而實現深層病灶、微小病灶或者遠端轉移病灶等的治療。
7、進一步地，所述基質金屬蛋白酶響應肽包括mmp-2，所述mmp-2底物具有如seq?idno.5所示的核苷酸序列，以及具有如seq?id?no.6所示的氨基酸序列。
8、進一步地，所述mrna對應的dna，具有如seq?id?no.1所示的核苷酸序列，以及具有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列。
9、另一方面，本專利技術提供一種提高il-12治療安全性的工程化mrna的制備方法，包括以下步驟：
10、s1、查詢鼠源p40受體結合域、基質金屬蛋白酶底物序列、p40、g4s連接序列、p35的cdna序列，設計并合成mrna-shield-ⅱ-12；
11、s2、將所述mrna所對應的dna序列插入載體中得到質粒；所述dna具有如seq?idno.1所示的核苷酸序列，以及具有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；
12、s3、制備mrna：將質粒酶切線性化后純化得到模板，通過體外轉錄和加帽后純化得到對應的mrna?shield-il-12。
13、進一步地，所述s2中，載體為pet28a體；所述s3中，酶切使用的酶為bspq-i酶。
14、再一方面，本專利技術提供一種如上技術方案中任一項所述的mrna用于制備減少系統性免疫不良反應、提高體內安全性的制劑的用途。
15、在一些實施方式中，為探索本專利技術設計得到的mrna?shield-il-12的抑制腫瘤生長的效果，對優化后的mrna?shield-il-12進行了對比實驗，實驗結果表明：shield-il-12與il-12均對腫瘤都有較好的抑制效果，但il-12組由于在小鼠體內產生了免疫不良反應，從而導致il-12組小鼠體重急劇下降并最終死亡，而shield-il-12組小鼠最終存活率達到80％。因此可知，注射shield-il-12和il-12均可明顯抑制腫瘤生長，且相比本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種提高IL-12治療安全性的工程化mRNA，其特征在于，所述mRNA從N端到C端依次包括受體結合域、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35。
2.如權利要求1所述的mRNA，其特征在于，所述受體結合域包括p40受體、p35受體、p19受體或抗p40納米抗體，所述mRNA從N端到C端依次包括p40受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35；或從N端到C端依次包括p35受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p35、p40；或從N端到C端依次包括p19受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35；
3.如權利要求2所述的mRNA，其特征在于，所述基質金屬蛋白酶響應肽包括MMP-2，所述MMP-2底物具有如SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列，以及具有如SEQ?ID?NO.6所示的氨基酸序列。
4.如權利要求3所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA對應的DNA，具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，以及具有如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。
5.一種提高IL-12治療安全性的工程化mRNA的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：<...
【技術特征摘要】
1.一種提高il-12治療安全性的工程化mrna，其特征在于，所述mrna從n端到c端依次包括受體結合域、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35。
2.如權利要求1所述的mrna，其特征在于，所述受體結合域包括p40受體、p35受體、p19受體或抗p40納米抗體，所述mrna從n端到c端依次包括p40受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35；或從n端到c端依次包括p35受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p35、p40；或從n端到c端依次包括p19受體、基質金屬蛋白酶響應肽、p40、p35；
3.如權利要求2所述的mrna，其特征在于，所述基質金屬蛋白酶響應肽包括mmp-2，所述mmp-2底物具有如seq?id?no.5所示的核苷酸序列，以及具有如seq?id?no.6所示的氨基酸序列。
4.如權利要求3所述的mrna，其特征在于，所述mrna對應的dna，具有如...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚蔚泓，杜禎，楊偲，符婷，劉湘圣，謝斯滔，甘紹舉，
申請(專利權)人：中國科學院杭州醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。