【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學技術檢測領域，具體涉及一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法。
技術介紹
1、隨著人們生活水平的提高，癌癥的發病率有所上升。目前臨床癌癥診斷的金標準是病理檢測，主要包括細胞學檢查、組織學檢查、免疫組織化學檢查等，但這些檢查往往是有創的。呼氣檢測具有安全無創、簡單便捷、接受度高等優點，呼氣中的揮發性有機物（volatile?organic?compounds，vocs）檢測在癌癥篩查中具有誘人的應用前景，例如多達40種vocs曾被不同研究組報道過為肺癌呼氣標志物，但其重復性并不好，關于肺癌的呼氣標志物，至今還沒有統一的結論。此外，體外細胞培養也被用于癌癥標志物的研究，但其獲得的癌細胞特征揮發物也存在相互不一致。
2、通過藥物誘導的方式產生疾病的氣體標志物已有臨床應用和相關研究。例如臨床上常用的檢測幽門螺桿菌的方法13c/14c呼氣試驗，受試者口服13c/14c標記的尿素膠囊，若胃內存在幽門螺桿菌感染，此時幽門螺桿菌產生的尿素酶，會將尿素分解為13c/14c標記的二氧化碳和氨，13c/14c標記的二氧化碳經胃腸道吸收入血后，最終經呼氣排出，此時檢測受試者的呼出氣體，若含有13c/14c標記的二氧化碳達到一定數值，說明體內存在幽門螺桿菌感染。
3、有氧糖酵解是癌細胞共有的能量代謝方式。正常細胞在有氧條件下，葡萄糖主要通過氧化磷酸化過程產生能量；在無氧條件下，主要通過糖酵解產生能量。warburg提出腫瘤細胞即使在有氧條件下，也主要通過糖酵解產生能量，這被稱為有氧糖酵解，也稱為warburg效應
技術實現思路
1、本專利技術的目的是：克服現有技術的不足，提供一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，通過對細胞糖酵解過程的調控，檢測細胞揮發物3-羥基-2-丁酮含量的變化，對細胞的良惡性進行判斷。
2、為實現上述目的，本專利技術公開了一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，包括以下步驟：
3、步驟1、檢測細胞培養頂空中釋放的揮發物3-羥基-2-丁酮的含量：
4、運用固相微萃取氣相色譜質譜聯用技術檢測細胞培養頂空中3-羥基-2-丁酮的含量。檢測分析條件如下：
5、固相微萃取條件：采用65?μm?pdms/dvb的固相微萃取纖維頭，先對纖維頭進行老化，老化溫度為200-260℃，老化時間為20-30?min，老化結束后將萃取纖維頭插入用parafilm膜進行封口的細胞培養瓶頂空中，對細胞揮發物進行萃取富集，萃取溫度為37℃，萃取時間為20-30?min。
6、色譜條件：色譜柱型號為tg-624silms（30?m?×?0.32?mm?×?1.8?μm）；載氣為高純氦氣（99.999%），載氣流速為1.5?ml/min；進樣口溫度200-260?℃；色譜柱升溫程序為：初始溫度40-50?℃，保持0.5-1?min，然后以5-10?℃/min升至180?℃，保持2?min，最后以10-15?℃/min升至200?℃，并保持5?min。
7、質譜條件：傳輸線溫度200-260?℃；離子源溫度200-260?℃；電子轟擊能量為70ev，質量掃描范圍是45-200?amu。
8、步驟2、在細胞中加入糖酵解抑制劑后繼續培養：
9、在細胞培養瓶中加入糖酵解抑制劑2-脫氧-d-葡萄糖（2-deoxy-d-glucose，2-dg），加入?2-dg的濃度范圍為5-15?mmol/l，也可以選擇加入糖酵解抑制劑?3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-brpa），加入3-brpa的濃度范圍為50-120?μmol/l。加入糖酵解抑制劑后用parafilm膜進行封口繼續培養細胞1-24小時。
10、步驟3、檢測加入糖酵解抑制劑后細胞釋放的揮發物3-羥基-2-丁酮的含量：
11、運用固相微萃取氣相色譜質譜聯用技術檢測加入糖酵解抑制劑后細胞培養頂空中3-羥基-2-丁酮的含量，檢測條件同步驟1。
12、步驟4、比較加入糖酵解抑制劑前與加入糖酵解抑制劑后細胞釋放的3-羥基-2-丁酮含量的差別；若加入糖酵解抑制劑后細胞釋放的3-羥基-2-丁酮的含量是加入糖酵解抑制劑前的2倍及以上，則判斷此細胞為癌細胞。
13、在上述技術方案中，所述步驟1中，檢測細胞頂空揮發物3-羥基-2-丁酮的含量可先用parafilm膜封口培養一段時間后再檢測，以避免培養箱內其他揮發物的干擾。
14、在上述技術方案中，所述步驟2中，加入的糖酵解抑制劑是2-脫氧-d-葡萄糖（2-deoxy-d-glucose，2-dg）、3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-brpa）或二氯乙酸（dichloroacetate，dca）等抑制劑的一種。
15、在上述技術方案中，所述步驟2中，加入糖酵解抑制劑后繼續培養細胞1~24小時。
16、在上述技術方案中，所述步驟1和步驟3中檢測細胞揮發物3-羥基-2-丁酮含量的方法包括光譜、質譜或電子鼻等。
17、本專利技術還公開了上述一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法在制備癌癥相關生物指標物檢測試劑盒中的應用。
18、本專利技術與現有技術相比的優點如下：
19、（1）關于癌癥的氣體標志物一直處于研究中，還沒有統一的可用于臨床診斷的氣體標志物。本專利技術從藥物誘導的方式出發，通過調控癌細胞共有的糖酵解代謝過程，檢測其特征揮發物，為癌癥氣體標志物的研究提供了一種新方法；
20、（2）檢測過程方便快捷，可以為人體腫瘤組織的的臨床病理診斷提供輔助指導。
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1.一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：所述步驟1中，檢測細胞頂空揮發物3-羥基-2-丁酮的含量先用Parafilm膜封口培養后再檢測。
3.根據權利要求1所述的一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：所述步驟2中，加入的糖酵解抑制劑是2-脫氧-D-葡萄糖、3-溴丙酮酸或二氯乙酸。
4.根據權利要求1所述的一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：所述步驟2中，加入糖酵解抑制劑后繼續培養細胞1~24小時。
5.根據權利要求1所述的一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：所述步驟1和步驟3中檢測細胞揮發物3-羥基-2-丁酮含量的方法包括：光譜、質譜或電子鼻。
6.一種權利要求1-5中任一所述的一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法在制備生物指標物檢測試劑盒中的應用。
【技術特征摘要】
1.一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：所述步驟1中，檢測細胞頂空揮發物3-羥基-2-丁酮的含量先用parafilm膜封口培養后再檢測。
3.根據權利要求1所述的一種基于糖酵解調控的癌細胞識別方法，其特征在于：所述步驟2中，加入的糖酵解抑制劑是2-脫氧-d-葡萄糖、3-溴丙酮酸或二氯乙酸。
【專利技術屬性】
技術研發人員：陸燕，葛殿龍，儲焰南，
申請(專利權)人：中國科學院合肥物質科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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