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    具有改變的PAM特異性的工程化的CRISPR-Cas9核酸酶制造技術
    
                            
    技術編號：42525601 閱讀：14 留言：0更新日期：2024-08-27 19:35
    
                        
    
                        
    
                            
                            具有改變的PAM特異性的工程化的CRISPR?Cas9核酸酶。具有改變的和改進的PAM特異性的工程化的CRISPR?Cas9核酸酶及其在基因組工程、表觀基因組工程、和基因組靶向中的應用。
    
                            
                            
    


    
                            

                            
    【技術實現步驟摘要】
    
                                
    本專利技術至少部分涉及工程化的成簇規律間隔的短回文重復(clusteredregularly?interspaced?short?palindromic?repeats,crispr)/crispr相關蛋白9(cas9)核酸酶，其具有改變和改進的前間區序列鄰近基序(protospacer?adjacent?motif,pam)特異性及其在基因組工程、表觀基因組工程和基因組靶向中的用途。

    技術介紹
    1、crispr-cas9核酸酶能夠在多種生物體和細胞類型中實現有效的、可定制的基因組編輯(sander&joung,nat?biotechnol?32,347-355(2014)；hsuet等人,cell?157,1262-1278(2014)；doudna&charpentier,science?346,1258096(2014)；barrangou&may,expertopin?biol?ther?15,311-314(2015))。cas9的靶位點識別由兩個稱為crrna和tracrrna的短rna指導(deltcheva等人,nature?471,602-607(2011)；jinek等人,science?337,816-821(2012))，可以將其融合至嵌合單指導rna(sgrna)中(jinek等人,science?337,816-821(2012)；jinek等人,elife?2,e00471(2013)；mali等人,science?339,823-826(2013)；cong等人,science?339,819-823(2013))。sgrna的5'端(源自crrna)可以與靶dna位點堿基配對，從而可以通過cas9/sgrna復合物直接對位點特異性切割進行重新編程(jinek等人,science?337,816-821(2012))。但是，cas9還必須識別與sgrna堿基配對的dna鄰近的特定前間區序列鄰近基序(pam)(mojica等人,microbiology?155,733-740(2009)；shah等人,rna?biol10,891-899(2013)；jinek等人,science?337,816-821(2012)；sapranauskas等人,nucleic?acids?res?39,9275-9282(2011)；horvath等人,j?bacteriol?190,1401-1412(2008))，這是啟動序列特異性識別所必需的要求(sternberg等人,nature?507,62-67(2014))，但也可以限制用于基因組編輯的這些核酸酶的靶向范圍。廣泛使用的化膿性鏈球菌(streptococcus?pyogenes)cas9(spcas9)識別短的ngg?pam(jinek等人,science?337,816-821(2012)；jiang等人,nat?biotechnol?31,233-239(2013))，在隨機dna序列中每8bp發生一次。相比之下，迄今已表征的其他cas9直系同源物可以識別更長的pam(horvath等人,jbacteriol?190,1401-1412(2008)；fonfara等人,nucleic?acids?res?42,2577-2590(2014)；esvelt等人,nat?methods?10,1116-1121(2013)；ran等人,nature?520,186-191(2015)；zhang等人,mol?cell?50,488-503(2013))。例如，金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus)cas9(sacas9)是幾種更適合病毒遞送的較小cas9直系同源物之一(horvath等人,j?bacteriol?190,1401-1412(2008)；ran等人,nature?520,186-191(2015)；zhang等人,mol?cell?50,488-503(2013))，識別更長的nngrrt?pam，預期在隨機dna中每32bp發生一次。擴大cas9直系同源物的靶向范圍對于包括修飾小遺傳元件(例如轉錄因子結合位點(canver等人nature.527(7577):192-7(2015)；vierstra等人,natmethods.12(10):927-30(2015))或通過在pam中定位序列差異進行等位基因特異性改變(courtney,d.g.等人gene?ther.23(1):108-12(2015))等各種應用是重要的。我們先前工程化了可以識別具有nga和ngcg?pam序列的位點的spcas9變體(kleinstiver等人,nature2015；wo?2016141224)，但是許多替代的pam序列仍然是不可靶向的。

    技術實現思路
    1、如本文所述，常用的化膿性鏈球菌cas9(spcas9)通過使用結構信息、基于細菌選擇的定向進化和組合設計進行工程化以識別新的pam序列。這些改變后的pam特異性變體能夠對野生型spcas9無法有效靶向的人類細胞中的報道基因位點和內源性基因位點進行強有力的編輯。本發現提供廣泛有用的spcas9變體，在本文中統稱為“變體”或“所述變體”。
    2、在第一方面，本專利技術提供分離的化膿性鏈球菌cas9(spcas9)蛋白，其在以下三個、四個、五個或全部六個位置具有突變：d1135、s1136、g1218、e1219、r1335和/或t1337，例如，在d1135、s1136、g1218、e1219、r1335和/或t1337(d1135x/s1136x/g1218x/e1219x/r1335x/t1337x，其中x為任意氨基酸)中的二個、三個、四個、五個或全部的位置具有突變，例如，包含具有所示突變的與seq?id?no：1的氨基酸序列至少80％、90％或95％相同的序列。在一些實施方案中，所述變體spcas9蛋白包含表a、1、2或3中所示的突變的組，例如以下突變的組之一：lrsvql、lrkiqk、lrsvqk、lwkiqk、vrkiqk、lwkiqk、iravql、vrklrs、grkiqk、swrvvv、swkvlk、tahfkv、msgvkc、lrsvrs、sktlrp、mwvhln、twsmrg、krrckv、vravql、vssvrs、vrsvrs、srmhck、gwkllr、gwkoqk、vakllr、vakiqk、vakilr、grkilr、vrkllr、iravql、vrkiqk或vrmhck變體(例如，對于ngtn?pam)；mqkser、vrkser、ickser、lrsver、lwletr、lsrwer、mqsvql、vrreer、icccer、lsrwqr、lwrvva、wmqayg、lwrsey、sqswrs、lkawrs、lwgwqh、mcsfer、lwmreq、lwrvva、hsswvr、mwsept、gsnyqs、fmqwvn、ycswvg、mcawcg、fmqwvr或sskwpa變體(例如，對于ngcn?本文檔來自技高網...
                            
    
                            
    【技術保護點】
    
                                
    1.一種分離的化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下三個、四個、五個或全部六個位置具有突變：D1135、S1136、G1218、E1219、R1335和/或T1337，其中所述突變不是VSREER或VSREQR。
    2.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其包含與SEQ?ID?NO：1的氨基酸序列至少80％相同的序列。
    3.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其包含表A、1、2或3中所示的突變的組。
    4.根據權利要求1-3任一項所述的分離的蛋白，其包含以下突變的組：LRSVQL、LRKIQK、LRSVQK、LWKIQK、VRKIQK、LWKIQK、IRAVQL、VRKLRS、GRKIQK、SWRVVV、SWKVLK、TAHFKV、MSGVKC、LRSVRS、SKTLRP、MWVHLN、TWSMRG、KRRCKV、VRAVQL、VSSVRS、VRSVRS、SRMHCK、GWKLLR、GWKOQK、VAKLLR、VAKIQK、VAKILR、GRKILR、VRKLLR、IRAVQL、VRKIQK或VRMHCK變體(例如，對于NGTNPAM)；MQKSER、VRKSER、ICKSER、LRSVER、LWLETR、LSRWER、MQSVQL、VRREER、ICCCER、LSRWQR、LWRVVA、WMQAYG、LWRSEY、SQSWRS、LKAWRS、LWGWQH、MCSFER、LWMREQ、LWRVVA、HSSWVR、MWSEPT、GSNYQS、FMQWVN、YCSWVG、MCAWCG、FMQWVR或SSKWPA變體(例如，對于NGCN?PAM)；LRSVRS、SRQMRG、MRARKE、SRMHCK、VRREQR、VRGEQR、LRLSAR、AWTEVTR、KWMMCG、VRGAKE、AWNFQV、LWTTLN、SRMHCK、CWCQCV、AEEQQR、GWEKVR、NRAVNG、LRSYLH、VRGNNR、VQDAQR、GWRQSK、AWLCLS、KWARVV、MWAARP、SRMHCK、VKMAKG、QRKTRE、LCRQQR、CWSHQR、SRTHTQ、LWEVIR、VSSVRS、VRSVRS、IRAVRS、SRSVRS、LWKIQK或VRMHCK變體(例如，對于NGAN?PAM)。
    5.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其進一步包含一種或多種降低核酸酶活性的突變，所述突變選自由在D10、E762、D839、H983、或D986處；和在H840或N863處的突變組成的組。
    6.根據權利要求5所述的分離的蛋白，其中所述突變是：
    7.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其進一步包含一種或多種增加特異性的突變，所述突變選自由在N497、R661、N692、M694、Q695、H698、K810、K848、Q926、K1003和R0160處，和任選地在K526和/或R691處的突變組成的組。
    8.根據權利要求7所述的分離的蛋白，其包含突變N692A、Q695A、Q926A、H698A、N497A、R661A、M694A、K810A、K848A、K1003A、R0160A、Y450A/Q695A、L169A/Q695A、Q695A/Q926A、Q695A/D1135E、Q926A/D1135E、Y450A/D1135E、L169A/Y450A/Q695A、L169A/Q695A/Q926A、Y450A/Q695A/Q926A、R661A/Q695A/Q926A、N497A/Q695A/Q926A、Y450A/Q695A/D1135E、Y450A/Q926A/D1135E、Q695A/Q926A/D1135E、L169A/Y450A/Q695A/Q926A、L169A/R661A/Q695A/Q926A、Y450A/R661A/Q695A/Q926A、N497A/Q695A/Q926A/D1135E、R661A/Q695A/Q926A/D1135E和Y450A/Q695A/Q926A/D1135E；N692A/M694A/Q695A/H698A、N692A/M694A/Q695A/H698A/Q926A；N692A/M694A/Q695A/Q926A；N692A/M694A/H698A/Q926A；N692A/Q695A/H698A/Q926A；M694A/Q695A/H698A/Q926A；N692A/Q695A/H698A；N692A/M694A/Q695A；N692A/H698A/Q926A；N692A/M694A/Q926A；N692A/M694A/H698A；M694A/Q695A/H698A；M694A/Q695A/Q926A；Q695A/H...
                            
    
                            
    【技術特征摘要】
    
                                
    1.一種分離的化膿性鏈球菌cas9(spcas9)蛋白，其在以下三個、四個、五個或全部六個位置具有突變：d1135、s1136、g1218、e1219、r1335和/或t1337，其中所述突變不是vsreer或vsreqr。
    2.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其包含與seq?id?no：1的氨基酸序列至少80％相同的序列。
    3.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其包含表a、1、2或3中所示的突變的組。
    4.根據權利要求1-3任一項所述的分離的蛋白，其包含以下突變的組：lrsvql、lrkiqk、lrsvqk、lwkiqk、vrkiqk、lwkiqk、iravql、vrklrs、grkiqk、swrvvv、swkvlk、tahfkv、msgvkc、lrsvrs、sktlrp、mwvhln、twsmrg、krrckv、vravql、vssvrs、vrsvrs、srmhck、gwkllr、gwkoqk、vakllr、vakiqk、vakilr、grkilr、vrkllr、iravql、vrkiqk或vrmhck變體(例如，對于ngtnpam)；mqkser、vrkser、ickser、lrsver、lwletr、lsrwer、mqsvql、vrreer、icccer、lsrwqr、lwrvva、wmqayg、lwrsey、sqswrs、lkawrs、lwgwqh、mcsfer、lwmreq、lwrvva、hsswvr、mwsept、gsnyqs、fmqwvn、ycswvg、mcawcg、fmqwvr或sskwpa變體(例如，對于ngcn?pam)；lrsvrs、srqmrg、mrarke、srmhck、vrreqr、vrgeqr、lrlsar、awtevtr、kwmmcg、vrgake、awnfqv、lwttln、srmhck、cwcqcv、aeeqqr、gwekvr、nravng、lrsylh、vrgnnr、vqdaqr、gwrqsk、awlcls、kwarvv、mwaarp、srmhck、vkmakg、qrktre、lcrqqr、cwshqr、srthtq、lwevir、vssvrs、vrsvrs、iravrs、srsvrs、lwkiqk或vrmhck變體(例如，對于ngan?pam)。
    5.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其進一步包含一種或多種降低核酸酶活性的突變，所述突變選自由在d10、e762、d839、h983、或d986處；和在h840或n863處的突變組成的組。
    6.根據權利要求5所述的分離的蛋白，其中所述突變是：
    7.根據權利要求1所述的分離的蛋白，其進一步包含一種或多種增加特異性的突變，所述突變選自由在n497、r661、n692、m694、q695、h698、k810、k848、q926、k1003和r0160處，和任選地在k526和/或r691處的突變組成的組。
    8.根據權利要求7所述的分離的蛋白，其包含突變n692a、q695a、q926a、h698a、n497a、r661a、m694a、k810a、k848a、k1003a、r0160a、y450a/q695a、l169a/q695a、q695a/q926a、q695a/d1135e、q926a/d1135e、y450a/d1135e、l169a/y450a/q695a、l169a/q695a/q926a、y450a/q695a/q926a、r661a/q695a/q926a、n497a/q695a/q926a、y450a/q695a/d1135e、y450a/q926a/d1135e、q695a/q926a/d1135e、l169a/y450a/q695a/q926a、l169a/r661a/q695a/q926a、y450a/r661a/q695a/q926a、n497a/q695a/q926a/d1135e、r661a/q695a/q926a/d1135e和y450a/q695a/q926a/d1135e；n692a/m694a/q695a/h698a、n692a/m694a/q695a/h698a/q926a；n692a/m694a/q695a/q926a；n692a/m694a/h698a/q926a；n692a/q695a/h698a/q926a；m694a/q695a/h698a/q926a；n692a/q695a/h698a；n692a/m694a/q695a；n692a/h698a/q926a；n692a/m694a/q926a；n692a/m694a/h698a；m694a/q695a/h698a；m694a/q695a/q926...
                            
    
                            
    【專利技術屬性】
    
                                技術研發人員：J·K·喬昂格，B·克萊因斯蒂弗，
    
        申請(專利權)人：通用醫療公司，
    
        類型：發明
    
        國別省市：
    
                            
    
                            
                        
    
                    
    
                    
                    
                     
                
    
                
                
    
                    
    
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