MHC-Ⅱ轉基因動物耐受性的研究方法技術

本發明專利技術提供了測試變異抗原的免疫原性的新穎方法。特別地，提供了基于使用轉基因動物的方法，其中所述轉基因動物被耐受化（ｔｏｌｅｒｉｓｅｄ）針對特定抗原和然后暴露于所述抗原的變體并測定免疫應答。在一個實施方案中，所述轉基因動物是人類Ⅱ類ＭＨＣ分子的轉基因小鼠并且變異抗體庫的免疫原性被測試。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術涉及用于測試蛋白質變體的免疫原性的體內系統。特別地，本專利技術涉及使用人類II類MHC分子轉基因小鼠的方法，其中使該小鼠對特定蛋白質耐受并然后使用所述特定蛋白質的變體測試免疫原性的誘導。另外，本專利技術涉及用于從蛋白質變體庫中選擇免疫原性降低的蛋白質的體內系統，藉此被耐受化的(tolerised)人類MHC轉基因小鼠被注射結合有不同變異蛋白質的文庫細胞系或顆粒，藉此結合有具有比文庫中其他蛋白質更低免疫原性的變異蛋白的特定細胞系或顆粒在體內被選擇。目前用于測試候選藥物蛋白在人類中潛在免疫原性的方法是有限的，主要因為非人類物種具有不同于人類的MHC(主要組織相容性抗原)分子并因此在測試動物中對注入蛋白的免疫應答不反映在人類中對相同蛋白質的預期免疫應答。因此，使用人類細胞或具有人類MHC的細胞來測試蛋白質免疫原性是重要的。一種特別有價值的方法是使用人類血液樣品在T細胞增殖測定中測試蛋白質。然而，該方法檢測T細胞在體外對受試蛋白質的應答并且迄今還沒有產生如體內發生的抗體生成的體外免疫原性方法得到證明。替代方法可以利用使用人類T和B細胞重建的小鼠或轉基因小鼠，其中家居(resident)小鼠MHC和在一些情況中的T細胞受體分子已經被它們的人類對應物所取代。然而，這些方法可能不會形成人類中免疫原性的準確預測，因為它們沒有考慮耐受性，特別是人類免疫系統對正常人類蛋白的耐受性。例如，人類MHC轉基因小鼠將依然預期產生(mount)對抗所注射的人類蛋白的免疫應答，因為所述小鼠將不耐受這樣的人類蛋白。因此需要改進的方法以促進蛋白質和蛋白質變體的體內免疫原性的測試，其考慮了在物種中對蛋白質的正常耐受性。因此，本專利技術的第一個方面提供了用于測試從哺乳動物抗原衍生的變異抗原在所述哺乳動物II類MHC分子的非人類轉基因哺乳動物中的免疫原性的方法，其中所述非人類哺乳動物不是所述哺乳動物抗原的來源，所述方法包括(a)通過與所述哺乳動物抗原的接觸使所述轉基因哺乳動物對所述哺乳動物抗原是耐受的；(b)將所述轉基因哺乳動物與所述變異抗原相接觸；和(c)檢測所述變異抗原在所述轉基因哺乳動物中的免疫原性。本專利技術提供了用于測試蛋白質和蛋白質變體的免疫原性的新型體內系統。如這里所討論的，變異抗原衍生于哺乳動物抗原。變異抗原可以包括具有增加、缺失或取代的或者通過化學方法衍生的蛋白質或多肽序列。所述抗原不是來源于在該方法中使用的非人類轉基因哺乳動物。特別地，本專利技術涉及使用允許展示人類T細胞表位的人類II類MHC分子轉基因小鼠并測試小鼠背景中人類蛋白質和蛋白質變體的潛在免疫原性的方法。在本專利技術的一個實施方案中，通過注射低濃度(例如，相當于人類血清和/或其他組織中發現的生理量)蛋白質在表達人類II類MHC(HLA-tg)種系的新生小鼠中誘導對人類蛋白的耐受性。蛋白質優選地是單體的并于免疫“惰性”緩沖液(如鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))中靜脈注入。在這類系統中，誘導耐受性的劑量頻率將根據耐受性被誘導針對的蛋白質而不同。例如，正常以高血清濃度存在的蛋白質最可能需要比那些正常以低生理濃度發現的蛋白質更頻繁地被注入以誘導耐受性。優選地，未成熟小鼠(例如新生小鼠)將被使用以保證耐受化(tolerising)蛋白質存在于T細胞發育并因此誘導中心耐受的過程中。典型地，年齡不超過6周的小鼠將被反復注入，其中來自胸腺的成熟CD4+和CD8+T細胞的生成減少(正常成人期)。具有針對受試蛋白質或受試變異蛋白的不變異形式的已建立的耐受性，被耐受化的小鼠然后將被注射受試蛋白或蛋白變體并隨后被檢測對抗受試蛋白或蛋白變體的免疫原性。在具有完整的免疫球蛋白基因的小鼠中，免疫原性可以通過針對受試蛋白或蛋白變體的抗體的生成而被檢測?；蛘撸c免疫原性有關的其他測定法可以被采用，如使用來自被耐受化的HLA-tg小鼠的外周血液、脾或派伊爾氏斑(Peyer′s Patch)來檢測受試蛋白-特異性T或B細胞應答的測定法。在本專利技術的另一個實施方案中，通過對表達人類轉基因(關于感興趣的蛋白質)的小鼠回交人類HLA-tg小鼠而在小鼠中誘導耐受性。例如，表達人類IgG的人類HLA-tg小鼠能夠被產生，其對人類IgG是耐受的。當人類IgG不是以這樣的方式表達，如允許可變(V)區體細胞突變(somaticmutation)、易位或重排，或者通過類轉換(class switching)的恒定(C)區改變，那么這些小鼠將對所表達的特定的人類IgG序列是耐受的但對某些人類V區體細胞突變、易位或重排或者通過類轉換的C區改變不是耐受的。當人類IgG以這樣的方式表達，如允許V區體細胞突變、易位或重排或者C區類轉換，那么這些小鼠將不僅對含有特定種系的V和C區序列的特定人類IgG是耐受的而且對已經經歷親和力成熟并對任一抗原特異的人類IgG也是耐受的。在這些條件下，可能生成表達內源性人類II類MHC的轉基因小鼠并且能夠獲得在人類II類MHC背景中的中心耐受所針對的人類蛋白。被整合入小鼠基因組的人類轉基因(編碼感興趣的人類蛋白)的拷貝數或者所述轉基因的表達效率(由不同因素決定，如轉錄和翻譯效率以及所述小鼠基因組內轉基因的定位)將決定所表達的蛋白質的量并可以是不同的以產生具有不同的人類轉基因表達水平的小鼠以便只有表達“生理量”的轉基因的小鼠被選擇用于回交至HLA-tg小鼠。使用注射或轉基因方法之一來誘導HLA-tg小鼠中對人類蛋白的耐受性，優選地使用表達單個人類II類MHC等位基因的小鼠。因此，上述方法被采用以在各自表達單個II類MHC異型(allotype)的一組小鼠中誘導耐受性。多個HLA-tg小鼠將被選擇以便獲得人類II類MHC異型的如所需比例一樣大的總體覆蓋度。應該理解，在本專利技術范圍內，其他方法可以被采用以使HLA-tg小鼠對感興趣的特定蛋白或蛋白變體是耐受的，包括誘導對特定蛋白耐受的特定白細胞的方法，刪除對特定蛋白有反應性的特定白細胞的方法和在免疫系統暴露于特定蛋白或變體過程中調節免疫系統以便誘導耐受性的方法。還應該理解，如果可能，不表達特定受試蛋白或蛋白變體的小鼠同系物的小鼠將優選用于本專利技術以避免這些小鼠對受試蛋白或蛋白變體的任何固有的耐受性。應該理解，根據本專利技術上面實施方案的被耐受化的HLA-tg小鼠能夠以多種方式被用于測試特定蛋白或蛋白變體的免疫原性或者用于根據免疫原性分級一組蛋白變體。在對特定蛋白耐受化的小鼠中，能夠測試對所述蛋白的變體的免疫原性，所述變體包括蛋白質中具有氨基酸改變的變體、具有氨基酸修飾((如脫酰胺或糖基化)差異、組成差異、物理差異(如聚集差異)或其他任何可能導致免疫原性的差異的變體。特別地，可以通過將感興趣的蛋白質以漸增的濃度注入被耐受化的小鼠來確定高和延長的劑量(dosing)的后果。還可以考察與注入途徑有關的免疫原性，其中蛋白質可以在被耐受化的小鼠中的不同部位注入并評估作為結果的免疫原性。應該理解，被耐受化的小鼠中的免疫原性的分析可以通過多種方法進行，包括在注射針對抗體的受試蛋白質或蛋白變體后測試來自小鼠的血液樣品或其他組織樣品(如派伊爾氏斑，脾)(如通過ELISA、RIPA、FACS和表面等離子體共振)；測試T細胞增殖或活化；測試蛋白反應性T細胞的生成，例如通過特定的肽-MHC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于測試從哺乳動物抗原衍生的變異抗原在所述哺乳動物Ⅱ類ＭＨＣ分子的轉基因非人類哺乳動物中的免疫原性的方法，其中所述非人類哺乳動物不是所述哺乳動物抗原的來源，所述方法包括：　　　?。ǎ幔┩ㄟ^與所述哺乳動物抗原的接觸使所述轉基因哺乳動物對所述哺乳動物抗原是耐受的；和　　　?。ǎ猓⑺鲛D基因哺乳動物與所述變異抗原接觸；和　　　?。ǎ悖z測所述變異抗原在所述轉基因哺乳動物中的免疫原性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】GB 2004-11-23 0425713.51.一種用于測試從哺乳動物抗原衍生的變異抗原在所述哺乳動物II類MHC分子的轉基因非人類哺乳動物中的免疫原性的方法，其中所述非人類哺乳動物不是所述哺乳動物抗原的來源，所述方法包括(a)通過與所述哺乳動物抗原的接觸使所述轉基因哺乳動物對所述哺乳動物抗原是耐受的；和(b)將所述轉基因哺乳動物與所述變異抗原接觸；和(c)檢測所述變異抗原在所述轉基因哺乳動物中的免疫原性。2.根據權利要求1所述的方法，其中與所述哺乳動物抗原的接觸是通過一種或多種編碼所述哺乳動物抗原的轉基因導入所述轉基因哺乳動物來實現的，其中所述一種或多種轉基因的表達使所述轉基因哺乳動物對與所述哺乳動物抗原的進一步接觸是耐受的。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述抗原是可溶性蛋白質并且其中所述轉基因哺乳動物與所述蛋白質接觸以誘導耐受性并然后用所述蛋白質的一種或多種變體攻擊。4.根據權利要求3所述的方法，其中所述抗原是單克隆抗體并且其中所述轉基因哺乳動物與可溶性單體抗體接觸以誘導耐受性并然后用所述單克隆抗體的一種或多種變體攻擊。5.根據權利要求3所述的方法，其中所述抗原是哺乳動物的多克隆抗體制劑并且其中所述轉基因哺乳動物與所述可溶性多克隆抗體接觸以誘導耐受性并然后用一種或多種單克隆抗體攻擊。6.如權利要求3-5任一項所述的方法，其中所述蛋白質是以佐劑或者是不溶的或固定化的形式。7.根據權利要求2所述的方法，其中所述抗原是非蛋白質分子并且其中所述轉基因哺乳動物與所述非蛋白質分子接觸以誘導耐受性并然后用所述非蛋白質分子的一種或多種變體攻擊。8.如權利要求7所述的方法，其中所述變異的非蛋白質分子是以佐劑或者是不溶的或固定化的形式。9.如權利要求1-8任一項所述的方法，其中所述非人類哺乳動物是嚙齒類動物。10.如權利要求9所述的方法，其中所述嚙齒類動物是小鼠并且所述哺乳動物的II類MHC分子是人類的，例如人類HLA-DR.轉基因小鼠。11.如權利要求10所述的方法，其中所述轉基因小鼠是與所述抗原接觸不超過6周但優選地在出生后32小時內以誘導對所述抗原的耐受性的新生小鼠。12.如權利要求9-11任一項所述的方法，其中所述哺乳動物抗原是人類抗原。13.如權利要求9-11任一項所述的方法，其中所述哺乳動物抗原是非人類抗原。14.根據權利要求10-13任一項所述的方法，其中所述轉基因小鼠被修飾以刪除表達所述抗原或所述抗原的變體的任何小鼠基因或致使其失活。15.根據權利要求14所述的方法，其中所述轉基因小鼠被修飾以刪除小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因或致使其失活，然后在用受試單克隆或多克隆抗體攻擊并檢測其免疫原性之前使所述小鼠對人類免疫球蛋白是耐受的。16.根據權利要求14所述的方法，其中所述轉基因小鼠被修飾以刪除小鼠蛋白基因或致使其失活，并然后在用一種或多種變異的非小鼠蛋白質攻擊和檢測其免疫原性之前使所述小鼠對非小鼠蛋白是耐受的。17.根據權利要求10所述的方法，其中所述轉基因小鼠編碼人類免疫球蛋白的重鏈和輕鏈并且其中所述轉基因小鼠隨后與一種或多種受試單克隆抗體或多克隆抗體接觸。18.根據權利要求10所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬修貝克，
申請(專利權)人：安迪拓普有限公司，
類型：發明
國別省市：GB[英國]