【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及藥材鑒定，尤其涉及一種用于鑒定黃精、滇黃精和多花黃精的indel引物及鑒定方法。
技術介紹
1、以植物、動物來源的中藥材在生物學上物種的確定，稱為基源。如果中藥材的標準來源項下收載有兩個及以上基原的情況稱之為多基原中藥材。盡管多基原中藥材緩解了中藥材市場空缺，然而多基原的混合使用嚴重影響重要臨床療效的有效性、安全性與質量可控性。為此，國家食品藥品監督管理總局于2016年頒布《中藥配方顆粒管理辦法(征求意見稿)》規定：“對栽培、養殖或野生采集的藥用動植物，應準確鑒定其物種，包括亞種、變種和品種，不同種的中藥材不可相互混用”。
2、2020年版藥典記載，中藥材黃精為百合科植物滇黃精(polygonatum?kingianumcoll.et?hemsl.)、黃精(polygonatum?sibiricum?red.)或多花黃精(polygonatumcyrtonema?hua)的干燥根莖，具有補氣養陰，健脾，潤肺，益腎的功能，用于脾胃氣虛，體倦乏力，胃陰不足，口干食少，肺虛燥咳，勞嗽咳血，精血不足，腰膝酸軟，須發早白，內熱消渴。三種基原黃精因其基原不同，導致功效成分含量上存在差異，使其藥效存在區別，從而威脅到用藥安全和療效，因此對其進行準確、快速的鑒定，是從基原保證黃精藥材質量控制的關鍵。
3、黃精屬植物具有較高的形態多樣性，自然野生狀態下，不同種間、同種不同居群個體間的形態特征常存在過渡類型，且種間地理分布交叉重疊，導致依據形態性狀不易對不同物種進行準確區分鑒定，特別是經過炮制后，更是難以對藥材
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術提出了一種用于鑒定黃精、滇黃精、多花黃精的indel引物及鑒定方法，旨在提高對黃精、滇黃精、多花黃精的鑒定速度。
2、第一方面，本專利技術提供了一種用于鑒定黃精、滇黃精和多花黃精的indel引物，包括4組indel引物，其核苷酸序列如seq?id?no.1～seq?id?no.4所示。
3、以上實施方式中，引物組合基于滇黃精、黃精和多花黃精葉綠體基因組序列，通過對比分析發現2個較長的indel標記，其中一個標記位于葉綠體基因組lsc區的trnf-gaa基因后的261bp處，黃精、多花黃精為：
4、“tcatatcatatatatcaaaaaaatgcagttgtctaaaactaaaaaac?ttctaagtttattttataggagttgaaggataggaaaagacagg”；
5、而滇黃精完全缺失此段序列，在序列兩端設計dhj正反引物；另一個標記位于葉綠體基因組lsc區的rps16基因后的330bp處，其中滇黃精為：
6、“tcgttttttgttttcgtgagtatggaatagaagagtgtcagataaaa?gtcgtt”；
7、而黃精、多花黃精完全缺失此段序列，在序列兩端設計hj正反引物，從而獲得引物信息。
8、第二方面，本專利技術還提供一種上述indel引物在黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定中的應用。
9、第三方面，本專利技術還提供一種試劑盒，該試劑盒包括上述用于鑒定黃精、滇黃精和多花黃精的indel引物。
10、第四方面，本專利技術還提供一種上述試劑盒在黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定中的應用。
11、第五方面，本專利技術還提供一種黃精、滇黃精、多花黃精的鑒定方法，該方法包括如下步驟：
12、步驟一、提取待測樣品的dna；
13、步驟二、以待測樣品的dna作為模板，利用權利要求1所述的indel引物進行pcr擴增；
14、步驟三、通過電泳對擴增產物進行檢測，根據目標條帶的大小，與黃精、滇黃精和多花黃精的標準圖譜對照，區分鑒別黃精、滇黃精和多花黃精基源。
15、在一些實施方式中，步驟二中，50μl?pcr的反應體系包括：premix?25μl，上、下游引物各1μl，dna模板1μl，加滅菌雙蒸水至50μl。
16、在一些實施方式中，步驟二中，pcr的反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃保溫5min。
17、在一些實施方式中，當步驟二所采用引物核苷酸序列為seq?id?no.1～seq?idno.2時，滇黃精的標準圖譜中pcr擴增產物大小為152bp；當步驟二所采用引物核苷酸序列為seq?id?no.3～seq?id?no.4時，滇黃精的標準圖譜中pcr擴增產物大小為227bp。
18、在一些實施方式中，當步驟二所采用引物核苷酸序列為seq?id?no.1～seq?idno.2時，黃精的標準圖譜中pcr擴增產物大小為243bp；當步驟二所采用引物核苷酸序列為seq?id?no.3～seq?id?no.4時，黃精的標準圖譜中pcr擴增產物大小為153bp。
19、在一些實施方式中，當步驟二所采用引物核苷酸序列為seq?id?no.1～seq?idno.2時，多花黃精的標準圖譜中pcr擴增產物大小為243bp；當步驟二所采用引物核苷酸序列為seq?id?no.3～seq?id?no.4時，多花黃精的標準圖譜中pcr擴增產物大小為227bp。
20、以上實施方式中，滇黃精的標準圖譜是通過上述核苷酸序列為seq?id?no.1～seqid?no.4的引物經過pcr擴增和電泳后得到，其中，按照seq?id?no.1～seq?id?no.2引物擴增滇黃精、黃精和多花黃精的pcr產物大小分別為152bp、243bp、243bp；按照seq?id?no.3～seq?id?no.4引物擴增滇黃精、黃精和多花黃精的pcr產物大小分別為227bp、153bp、227bp。
21、上述步驟三中，區分鑒別黃精、滇黃精和多花黃精基源的方法包括：
22、以seq?id?no.1～seq?id?no.2引物進行pcr擴增，當樣品pcr產物大小為152bp，其電泳條帶與滇黃精基原植物電泳條帶齊平時，則認定其基原為滇黃精；
23、以seq?id?no.3～seq?id?no.4引物進行pcr擴增，當樣品pcr產物大小為153bp，其電泳條帶與黃精基原植物電泳條帶齊平時，則認定其基原為黃精；
24、以seq?id?no.1～seq?id?no.2引物進行pcr擴增，當樣品pcr產物大小為243bp，其電泳條帶與黃精基原植物電泳條帶齊平，且以seq?id?no.3～seq?id?no.4引物進行pcr擴增，當樣品pcr產物大小為227bp，其電泳條帶與滇黃精基原植物電泳條帶齊平時，則認定其基原為多花黃精。
25、本專利技術相對于現有技術具有以下有益效果：
26、本專利技術建立了一種基于indel引物標記的黃精基原鑒定方法，可以在一天之內實現對滇黃精、黃精和多花黃精基原的鑒定，該方法操作簡單，檢測周期短，特異性強，具有很高的可行性本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于鑒定黃精、滇黃精和多花黃精的InDel引物，其特征在于，包括4組InDel引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1～SEQ?ID?No.4所示。
2.如權利要求1所述的的InDel引物在黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定中的應用。
3.一種含有權利要求1所述的InDel引物的試劑盒。
4.如權利要求3所述的試劑盒在黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定中的應用。
5.一種黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.如權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，步驟二中，PCR的反應體系包括：Premix25μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，加滅菌雙蒸水至50μL。
7.如權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，步驟二中，PCR的反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃保溫5min。
8.如權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，當步驟二所采用引物核苷酸序列為SEQID?No.1～SEQ?ID?No.2時，滇
9.如權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，當步驟二所采用引物核苷酸序列為SEQID?No.1～SEQ?ID?No.2時，黃精的標準圖譜中PCR擴增產物大小為243bp；當步驟二所采用引物核苷酸序列為SEQ?ID?No.3～SEQ?ID?No.4時，黃精的標準圖譜中PCR擴增產物大小為153bp。
10.如權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，當步驟二所采用引物核苷酸序列為SEQID?No.1～SEQ?ID?No.2時，多花黃精的標準圖譜中PCR擴增產物大小為243bp；當步驟二所采用引物核苷酸序列為SEQ?ID?No.3～SEQ?ID?No.4時，多花黃精的標準圖譜中PCR擴增產物大小為227bp。
...【技術特征摘要】
1.一種用于鑒定黃精、滇黃精和多花黃精的indel引物，其特征在于，包括4組indel引物，其核苷酸序列如seq?id?no.1～seq?id?no.4所示。
2.如權利要求1所述的的indel引物在黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定中的應用。
3.一種含有權利要求1所述的indel引物的試劑盒。
4.如權利要求3所述的試劑盒在黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定中的應用。
5.一種黃精、滇黃精和多花黃精的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.如權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，步驟二中，pcr的反應體系包括：premix25μl，上、下游引物各1μl，dna模板1μl，加滅菌雙蒸水至50μl。
7.如權利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，步驟二中，pcr的反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃保溫5min。
8.如權利要求5所述的鑒定方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳健，賀友安，王喆，楊強，陳建軍，程楊洋，湛文軒，段星昱，趙凡，
申請(專利權)人：勁牌有限公司，
類型：發明
國別省市：
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