【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及檢測，特別涉及豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的檢測方法。
技術(shù)介紹
1、產(chǎn)氣莢膜梭菌，又稱魏氏梭菌，是一種厭氧性革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，可引起動物壞死性腸炎、腸毒血癥，同時也是人畜創(chuàng)傷性壞疽及人類食物中毒的主要病原菌，該菌的主要致病因子是其產(chǎn)生的外毒素。主要有：α毒素（c.perfringensalpha‐toxin，cpa）、β毒素（c.perfringens?beta‐toxin，cpb）、ε毒素（epsilon?toxin，etx）、ι毒素（immunotoxin，itx）、腸毒素（c.perfringens?enterotoxin，cpe）和net?b（necrotic?enteritis?b‐like?toxin，net?b）毒素。根據(jù)產(chǎn)生毒素的種類，該菌分為a、b、c、d、e、f、g等7個毒素型。產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素（cpa）可由所有型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生，是a型產(chǎn)氣莢膜梭菌最主要的毒力因子，也是第一個被發(fā)現(xiàn)既有酶活性，又有毒素特性的細菌蛋白，在產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病過程中起重要作用。cpa主要引起哺乳動物的氣性壞疽和綿羊黃羊病。
2、cpa是一種依賴于鋅離子的多功能性金屬酶，在鈣離子作用下結(jié)合到細胞膜上，使膜上的磷脂類化合物發(fā)生水解，具有細胞毒性、溶血活性、促使血小板聚集和增加血管滲透性等多種毒性作用，cpa有冷熱溶血效用（hot?&?cold?hemolysis），即在37℃時，cpa與紅細胞共孵育并不會使紅細胞發(fā)生溶血，當迅速冷卻至4℃時，紅細胞會進一步出現(xiàn)裂解，目前在小鼠、家
3、梭菌a毒素亞單位疫苗可以通過免疫母豬，給與乳豬充分的母乳喂養(yǎng)，有效預(yù)防產(chǎn)房乳豬腹瀉情況，但是通過乳豬腹瀉評估疫苗有效性時間周期長。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)提供了豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的檢測方法。本專利技術(shù)提供了非疾病診斷目的的豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的檢測方法，包括：取不同稀釋倍數(shù)的待測樣本和梭菌α毒素混合，恒溫反應(yīng)后與紅細胞懸液混合，再次恒溫反應(yīng)，測定所述梭菌α毒素對所述紅細胞的裂解率；根據(jù)所述紅細胞的裂解率判定所述待測樣品中豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的效價。
2、為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了非疾病診斷目的的豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的檢測方法，包括：取不同稀釋倍數(shù)的待測樣本和梭菌α毒素混合，恒溫反應(yīng)后與紅細胞懸液混合，再次恒溫反應(yīng)，測定所述梭菌α毒素對所述紅細胞的裂解率；根據(jù)所述紅細胞的裂解率判定所述待測樣品中豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的效價。
4、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述梭菌α毒素的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
5、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，編碼所述梭菌α毒素的核苷酸序列如seq?idno.2所示。
6、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述梭菌α毒素的最小紅細胞裂解劑量（mcd）包括40μg/ml。
7、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述梭菌α毒素的使用劑量≥1mcd。
8、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述梭菌α毒素的使用劑量包括4mcd。
9、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述紅細胞懸液包括體積占比為5%的紅細胞懸液。
10、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述恒溫反應(yīng)的溫度包括37℃；
11、所述恒溫反應(yīng)的時間包括30~40min。
12、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述梭菌α毒素、所述待測樣本和所述紅細胞懸液的體積比包括1：1：1。
13、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述判定的方法為：當所述待測樣本的紅細胞裂解率＜50%時，所對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)即為所述待測樣本中所述豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的效價。
14、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述待測樣本包括血清。
15、在本專利技術(shù)的一些具體實施方案中，所述待測樣本的預(yù)處理方法包括：取待測樣本，離心取上清，于56℃，30min條件下滅活。
16、本專利技術(shù)還提供了豬產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗非疾病診斷目的的有效性評價方法，根據(jù)所述檢測方法檢測待測樣本中的中和抗體水平；所述待測樣本為接種豬產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的血清。
17、本專利技術(shù)提供了如下有益效果：
18、本專利技術(shù)建立的中和抗體檢測方法可以有效解決梭菌a毒素亞單位疫苗乳豬腹瀉保護有效性評估較繁瑣，無可用商品化抗體檢測試劑盒的問題，可以以疫苗免疫后抗體值高低評判疫苗有效性，指導(dǎo)生產(chǎn)進行免疫程序設(shè)定及修改。并且本專利技術(shù)建立的中和抗體檢測方法靈敏度高，操作簡單。
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1.非疾病診斷目的的豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的檢測方法，其特征在于，包括：取不同稀釋倍數(shù)的待測樣本和梭菌α毒素混合，恒溫反應(yīng)后與紅細胞懸液混合，再次恒溫反應(yīng)，測定所述梭菌α毒素對所述紅細胞的裂解率；根據(jù)所述紅細胞的裂解率判定所述待測樣品中豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的效價。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述梭菌α毒素的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述梭菌α毒素的使用劑量≥1MLD。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述紅細胞懸液包括體積占比為5%的紅細胞懸液。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述恒溫反應(yīng)的溫度包括37℃；
6.如權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其特征在于，所述梭菌α毒素、所述待測樣本和所述紅細胞懸液的體積比包括1：1：1。
7.如權(quán)利要求1至6任一項所述的方法，其特征在于，所述判定的方法為：當所述待測樣本的紅細胞裂解率＜50%時，所對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)即為所述待測樣本中所述豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的
8.如權(quán)利要求1至7任一項所述的方法，其特征在于，所述待測樣本包括血清。
9.如權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其特征在于，所述待測樣本的預(yù)處理方法包括：取待測樣本，離心取上清，于56℃，30min條件下滅活。
10.豬產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗非疾病診斷目的的有效性評價方法，其特征在于，根據(jù)如權(quán)利要求1~9任一項所述的檢測方法檢測待測樣本中的中和抗體水平；所述待測樣本為接種豬產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的血清。
...【技術(shù)特征摘要】
1.非疾病診斷目的的豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的檢測方法，其特征在于，包括：取不同稀釋倍數(shù)的待測樣本和梭菌α毒素混合，恒溫反應(yīng)后與紅細胞懸液混合，再次恒溫反應(yīng)，測定所述梭菌α毒素對所述紅細胞的裂解率；根據(jù)所述紅細胞的裂解率判定所述待測樣品中豬產(chǎn)氣莢膜梭菌中和抗體的效價。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述梭菌α毒素的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述梭菌α毒素的使用劑量≥1mld。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述紅細胞懸液包括體積占比為5%的紅細胞懸液。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述恒溫反應(yīng)的溫度包括37℃；
6.如權(quán)利要求1至5任一項所...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：牛旻，楊瑞華，魯璐，肖紅照，李欣雨，
申請(專利權(quán))人：牧原食品股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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