穩定表達ＨＬＡ－Ｇ分子的人胚胎干細胞分化細胞制造技術

本發明專利技術提供了一種穩定表達ＨＬＡ－Ｇ分子的人胚胎干細胞分化細胞，為臨床細胞移植提供了豐富的細胞來源，解決了臨床將人胚胎干細胞定向分化細胞進行移植時的免疫排斥問題，具有深遠的臨床應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞分化細胞。
技術介紹
人胚胎干細胞具有自我復制及多潛能分化的特性，理論上可以分化為機體任何細 胞，例如心肌細胞，胰腺13細胞，多巴胺能神經元等，為臨床細胞移植提供了豐富的細胞 來源。但是人胚胎干細胞分化細胞在移植過程中面臨著免疫排斥的重大問題。HLA-G屬于 非經典HLA-I類基因(HLA-Ib)，有7種亞型，其中4種為膜結合型(HLA-G1、 G2、 G3、 G4)和 3種可溶型(HLA-G5、 G6、 G7)，主要分布在母體胎兒界面絨毛外細胞滋養細胞，在母胎免疫 耐受及器官移植方面具有重要的作用。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種能穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞 分化細胞，解決人胚胎干細胞分化細胞在移植過程中面臨著免疫排斥的重大問題。 本專利技術提供的技術方案是一種穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞分化細胞， 其特征在于由下述方法得到 —、構建HLA-G的慢病毒真核表達載體，步驟如下 1)獲取胎盤組織cDNA ; 2)設計引物，PCR擴增獲得HLA-G序列并回收； 3)將其連接T-easy質粒，酶切，其中上游XbaI內切酶，下游BsrGI內切酶，測序鑒 定，測序結果如SEQ ID No. 3所述； 4)將擴增獲得的HLA-G與慢病毒載體質粒連接； 5)在293T細胞中包裝慢病毒； 二、建立穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞并檢測其全能性 三、誘導穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞隨機及定向分化細胞，檢測這些分化細胞HLA-G分子的表達。 上述第2)步中，所述引物序列是上游引物序列如SEQ ID No. l所述，下游引物序 列如SEQ ID No. 2所述。 上述第5)步中，慢病毒包裝過程如下 1)轉染時三種質粒的比例DB : CMVA : PMDG = 3 :4:1; 2)包裝細胞為293T; 3)轉染前24小時，293T細胞傳代；4)按如下步驟操作(以100mm的培養皿為例)a) 1. 5ml的無血清0pti-MEM稀釋60ul Lipo2000，混勻，RT，放置5分鐘; b) 1. 5ml的無血清0pti-MEM稀釋24ug質粒，混勻 c)將上述稀釋液混合、混勻、RT、放置20分鐘 5)將3ml混合液加入含有適量培養基的293T細胞的培養皿中； 6) 37°C 、5% C02培養箱培養8h，換液(預熱)，并開始計時； 7) 24h及48h分別收集培養液，4。C避光保存；8)2000rpm離心5min，取上清約lml，加入K562或直293T細胞中，同時力口 2ul ; Polybrene(4ug/u1)，2小時后補加lml新鮮培養液，24_48h觀察細胞是否出現綠色熒光； 9)0. 45ul濾器(Milipore公司)過濾收集的培養上清液 10)采用柱子(Milipore公司，Amicon Ultra-15centrif卿l Filter Devices貨 號UFC910096) ，4000g，30分鐘; 11)收集病毒濃縮液，滴度測定，分裝，-S(TC保存。 上述第二步中，慢病毒轉染人胚胎干細胞建立穩定表達HLA-G分子的過程是 (1)膠原酶IV消化人胚胎干細胞； (2)PBS洗2遍； (3)加入2ml培養液將人胚胎干細胞重懸； (4)同時力口入60ul病毒液及8ul Polybrene (5mg/ml); (5) 2小時后離心，PBS洗2遍，去除病毒 (6)將人胚胎干細胞重新種植于飼養層細胞上，72小時后加入50ug/ml潮霉素B 篩選，獲得穩定表達HLA-G的人胚胎干細胞。 本專利技術的具有如下優點本專利技術采用慢病毒轉染系統對人胚胎干細胞進行基因修 飾。對于人胚胎干細胞進行基因修飾目前最好的技術手段就是慢病毒轉染系統。該系統的 優點是以HIV-1為基礎構建的慢病毒載體具有可感染非分裂細胞、目的基因整合至靶細 胞基因組長期表達、免疫反應小等優點，適于體內基因治療，是目前理想的基因轉移載體。 本專利技術人設計了將具有免疫耐受作用的HLA-G分子穩定轉染人胚胎干細胞，并使其分化細 胞依然表達HLA-G分子。本專利技術對于解決臨床將人胚胎干細胞定向分化細胞進行移植時的 免疫排斥問題奠定基礎，具有深遠的臨床應用價值。具體實施例方式下面通過具體實施方式的詳細描述來進一步闡明本專利技術，但并不是對本專利技術的限 制，僅僅作示例說明。 實施例1 :人胚胎干細胞HLA-G蛋白的表達 1 、人胚胎干細胞HLA-G蛋白的表達 (1) Western-blot檢驗人胚胎干細胞HLA-G蛋白的表達 采用MEM-G/1單克隆抗體(Serotec公司)1 : 500檢驗人胚胎干細胞HLA-G蛋白 的表達。具體步驟見《分子克隆第三版》 (2)免疫熒光法檢驗人胚胎干細胞HLA-G蛋白的表達 采用0ct-4單克隆抗體(Chemicon公司)(1 : 100)及MEM-G/9單克隆抗體 (1 : 25)共染人胚胎干細胞，檢驗人胚胎干細胞HLA-G蛋白的表達。具體步驟見《分子克 隆第三版》 結果人胚胎干細胞不表達HLA-G蛋白 實施例2 :誘導人胚胎干細胞隨機分化及定向分化多巴胺能神經元、胰腺細胞并檢驗其HLA-G分子的表達 1、人胚胎干細胞隨機分化及HLA-G分子的表達 將人胚胎干細胞用胰酶消化，種植于無飼養層，鋪有matrigiel的培養皿中，去除 培養液中bFGF因子，使其隨機分化。并于1周、2周、3周、4周收集細胞，提取蛋白，通過 Western-blot檢測這些分化細胞HLA-G分子的表達。結果表明人胚胎干細胞分化細胞不表 達HLA-G蛋白。 2、人胚胎干細胞誘導分化為多巴胺能神經元并檢測其HLA-G分子的表達 將人胚胎干細胞與PA6(小鼠骨髓基質細胞)共培養誘導人胚胎干細胞向多巴胺 能神經分化，3周后，檢測細胞Nestin，酪氨酸羥化酶神經標志物。通過Western-blot檢測 這些分化細胞HLA-G分子的表達。 人胚胎干細胞誘導分化為多巴胺能神經元特異性表達酪氨酸羥化酶及Nestin蛋 白，不表達HLA-G蛋白。 3、人胚胎干細胞誘導分化為胰腺細胞并檢測其HLA-G分子的表達 首先用懸浮培養生成EB，并平鋪于胰島素_轉鐵蛋白_硒_纖維結合素培養基中， 再在含bFGF、 N2和B27的培養基中擴增胰腺前體細胞。接著降低培養基中的葡萄糖濃度， 撤消bFGF，加入煙酰胺。最后，分離細胞并懸浮培養以使細胞繼續生長，形成細胞集落，然后 檢測培養液中胰島素的含量。通過Western-blot檢測這些分化細胞HLA-G分子的表達。 人胚胎干細胞誘導分化為胰腺細胞特異性表達胰島素及胰島素前體，但不表達 HLA-G蛋白。 實施例3 :制備穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞分化細胞 1 、構建HLA-G的慢病毒真核表達載體 [OO56] (1)獲取胎盤組織cDNA ; (2)設計引物，引物序列是上游引物序列如SEQ ID No. 1所述，即 ATCGTCTAGAATGGTGGTCATGG ;下游引物序列如SEQ ID No. 2所述，即ATCGTGTACATCACTTGTC ATCGTCGTCCTTGTAGTCATCTGAGCTC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種穩定表達ＨＬＡ－Ｇ分子的人胚胎干細胞分化細胞，其特征在于由下述方法得到：　　一、構建ＨＬＡ－Ｇ的慢病毒真核表達載體，步驟如下：　　１）獲取胎盤組織ｃＤＮＡ；　　２）設計引物，ＰＣＲ擴增獲得ＨＬＡ－Ｇ序列并回收；　　３）將其連接Ｔ－ｅａｓｙ質粒，酶切、測序鑒定；　　４）將ＨＬＡ－Ｇ與慢病毒載體質粒連接；　　５）在２９３Ｔ細胞中包裝慢病毒；　　二、建立穩定表達ＨＬＡ－Ｇ分子的人胚胎干細胞并檢測其全能性；　　三、誘導穩定表達ＨＬＡ－Ｇ分子的人胚胎干細胞隨機及定向分化細胞，檢測這些分化細胞ＨＬＡ－Ｇ分子的表達。

【技術特征摘要】
一種穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞分化細胞，其特征在于由下述方法得到一、構建HLA-G的慢病毒真核表達載體，步驟如下1)獲取胎盤組織cDNA；2)設計引物，PCR擴增獲得HLA-G序列并回收；3)將其連接T-easy質粒，酶切、測序鑒定；4)將HLA-G與慢病毒載體質粒連接；5)在293T細胞中包裝慢病毒；二、建立穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞并檢測其全能性；三、誘導穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞隨機及定向分化細胞，檢測這些分化細胞HLA-G分子的表達。2. 根據權利要求1所述的穩定表達HLA-G分子的人胚胎干細胞分化細胞，其特征在于 第2)步中，所述引物序列是上游引物序列如SEQ ID No. l所述，下游引物序列如SEQ ID ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙宏喜，姚元慶，李凌松，王莉，
申請(專利權)人：趙宏喜，姚元慶，李凌松，王莉，
類型：發明
國別省市：87[中國|西安]