本發明專利技術公開了一種適用于同時分析毒死蜱和甲基對硫磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備，它包括毒死蜱人半工抗原和甲基對硫磷人工半抗原結構以及毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備方法。本發明專利技術制備的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原可用于制備適用于同時分析毒死蜱和甲基對硫磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒，該試劑盒能用于水、土壤、蔬菜等食品中及中毒樣品中毒死蜱殘留和甲基對硫磷的快速檢測，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本低于傳統的檢測方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于殘留農藥檢測領域，涉及一種適用于同時針對殘留毒死蜱和甲 基對硫磷進行分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體 及通用包被抗原的制備。
技術介紹
農藥及其代謝物傳統的殘留分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)、高效液相 色譜(HPLC)、質譜(MS)等物理化學分析手段，但由于農藥使用規模不斷擴大， 農藥殘留造成環境影響和人類健康的慢性和長期效應日益受到人們關注和擔 憂，對農藥殘留的限制也越來越嚴格，對分析測定對象、種類、數量、范圍、 指標等諸方面都提出了新的要求和更高的標準，但傳統的理化分析方法通常繁 瑣復雜，工作量大，儀器昂貴，并要有熟練的技術人員及較長的分析周期。因 此人們迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及廉價的檢測技術能在野外和實驗室 內進行大批量的檢測應用。免疫分析法正具備這些優點，所以盡管將免疫分析 用于農藥殘留分析的時間很短，仍然很快用于環境樣品和食品樣品中農藥殘留 的分析。毒死蜱(Chlorpyrifos)，自1965年由美國Dow公司開發推廣后即作為 一種廣 譜性高效殺蟲劑，在世界范圍內廣泛應用于糧食、棉花等經濟作物的多種害蟲 防治，并且對地下害蟲、家畜害蟲以及衛生害蟲也有很好的防治效果。但是由 于毒死蜱對人畜的毒性相當高，近年來，因毒死蜱中毒的報道，仍然屢見不鮮。 尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，對人體健康造成極大的危害，這已引起人 們的關注。甲基對硫磷(Parathion-methyl)由1944年德國希拉臺爾(G.Schrader) 化學家首先合成，1949年拜爾公司首先建廠生產，嗣后世界各地大量有多家公 司相繼投產，上世紀60年代之后我國產、用量都很大。甲基對硫磷作為一種廣 譜性高效殺蟲劑，在世界范圍內廣泛應用于糧食、棉花等經濟作物的害蟲防治。 但是由于甲基對硫磷對人畜劇毒，因甲基對硫磷中毒的報道，屢見不鮮，目前 我國雖然已經禁止生產和使用甲基對硫磷。開發一種簡單快速同時適用于毒死 蜱和甲基對硫磷農藥殘留現場監控的痕量分析方法具有重要的現實意義。檢測毒死蜱和甲基對硫磷殘留量常規方法為高效液相色譜法等。然而該方 法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，且該方法需要昂貴的儀器， 且過程繁瑣，不適合大批量樣品的檢測與分析。免疫分析為毒死蜱和甲基對硫 磷的殘留檢測提供了一個新的分析檢測途徑。目前的文獻和專利公開'了用于分析殘留毒死蜱的酶聯免疫吸附測定試劑盒或分析殘留甲基對硫磷的酶聯免疫吸 附測定試劑盒及其制備方法，而現有技術中沒有同時分析殘留毒死蜱和甲基對 硫磷的酶聯免疫吸附測定試劑盒及其制備方法的技術。本專利技術正是針對這一空白，經過專利技術人長時間的實驗和測試，得到了適用 于同時分析殘留毒死蜱和甲基對硫磷的酶聯免疫吸附測定試劑盒的關鍵原料毒 死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原的制備技術。使用本專利技術的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備的同時分析殘留毒死蜱和甲基對硫 磷的酶聯免疫吸附測定試劑盒保質期不低于1年，對殘留毒死蜱和甲基對硫磷在蔬菜中的最低檢出濃度分別為12.0、 10.0ng/ml。
技術實現思路
要解決的問題本專利技術的目的是提供一種毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原的 制備技術。本專利技術的另一目的是本專利技術所制備的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用 包被抗原可以用于制備同時分析殘留毒死蜱和甲基對硫磷的酶聯免疫吸附測定 試劑盒。毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原同時和牛血清白蛋白反應制備 毒死蜱和甲基對硫磷通用人工抗原是本專利技術的重要特征之一。毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原同時和卵清蛋白反應制備毒死 蜱和甲基對硫磷通用包被抗原是本專利技術的另一重要特征。技術方案毒死蜱和甲基對硫磷通用人工抗原制備毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷 人工半抗原同時和牛血清白蛋白反應，同時發生如下兩個反應<formula>formula see original document page 4</formula>操作步驟計算量的人工半抗原、三正丁胺分別溶于DMF中的兩混合物a 和b，將b加于a中得混合物c。將溶解有氯甲酸異丁酯的DMF溶液于4'C滴到c中，反應l小時得d。將計算量牛血清白蛋白溶于定量PH-8.7、 0.05M的 硼酸鹽緩沖溶液中，然后于18。C以下將d滴加其中，室溫反應12小時。所得反 應液裝入透析袋，于PH-7.4、 O.OIM緩沖溶液中4'C條件透析至透析液中檢不 出半抗原紫外吸收(OD282 ),精確量取透析后的蛋白質溶液體積，測定蛋白質濃 度和結合比為40~50，分裝，-2(TC保存。毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原制備將毒死蜱和甲基對硫磷通用人工 抗原制備中的牛血清白蛋白換成卵清蛋白并且減半使用，用相同的操作方法即 可制得毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原，結合比為20~30，分裝，-2(TC保 存。毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體的制備將人工合成的毒死蜱和甲基對硫磷免疫原(即毒死蜱人工半抗原和甲基對硫 磷人工半抗原與牛血清白蛋白結合形成的偶聯物(CBRH-BSA))多次注射新西蘭 兔刺激其體的免疫系統產生能對毒死蜱和甲基對硫磷農藥分子或毒死蜱和甲基 對硫磷包被原(毒死蜱和甲基對硫磷半抗原與卵清蛋白人工合成的偶聯物 (CBRH-OVA))特異性識別結合的免疫球蛋白(IgG)。一、 免疫原的選擇和制備1、 選擇毒死蜱和甲基對硫磷半抗原與載體蛋白結合比在40-50的偶聯物作 免疫原。2、 弗氏佐劑的制備石蠟油與羊毛脂3: 1混勻濕熱高壓滅菌得弗氏不完 全佐劑。在弗氏不完全佐劑中按規2mg/ml加卡介苗凍干粉混勻得弗氏完全佐劑。3、 佐劑免疫原的制備將免疫原溶液慢慢解凍，用生理鹽水稀釋至 3mg/ml(以載體蛋白計)按免疫劑量吸入適當容積于注射器中，且免疫原與佐劑以 1: 1(V/V)混合，后以用無菌橡膠管相連的兩支5ml滅菌玻璃注射器(總體積不超 過4ml)交替推動，使佐劑與免疫原溶液充分混合乳化，形成油包水乳液，直至 滴入冰水中暫不擴散為止。二、 免疫方案選用健康純白新西蘭雄兔(體重約1.5kg左右)作為免疫動物。注射前耳靜脈 采血制備少時對照血清(l-2ml),低溫貯藏備用。然后將上述已制備好的佐劑免 疫原用背部皮內多點注射法注射，以20-25點左右小劑量注射入兔體內，總共注 射7次，時間間隔第一次與第二次為4個周，其后每次的時間間隔為2周。四 免后7-10天，耳緣靜脈采血制備少量抗血清，以陰性血清作對照，用瓊脂雙擴 散法和間接ELISA法檢測血清效價。待瓊擴散效價達1: 16以上，以間接ELISA 法測定抗血清終點效價達大于10萬，中點效價大于2萬。頸動脈全采血(無菌)制備抗血清于-2(TC凍存。 三、抗體的純化1、 硫酸銨鹽法(1)50ml燒杯中，X毫升血清+Xml生理鹽水，置于電磁攪 拌器上。(2)緩慢滴入2X毫升飽和硫酸銨(PH7.0),使達到50%的飽和度。控制 攪拌速度不出氣泡。滴加完畢，繼續攪拌5分鐘。(3)室溫放置30分鐘。(4)離心 3000轉/分x20分鐘。(5)棄去上清液，沉淀物溶于2X亳升生理鹽水，逐滴加飽 和硫酸銨Xml使達33。/。飽和度。(6)室溫放置M分鐘。(7)棄去上清液，將沉淀 物本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種適用于同時分析毒死蜱和甲基對硫磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備，其特征在于，毒死蜱人工半抗原和甲基對硫磷人工半抗原以一定比例與牛血清白蛋白結合制得通用人工抗原，按照常規方法使用新西蘭白兔免疫制備毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體，毒死蜱人工半抗原和甲基對硫磷人工半抗原以一定比例與卵清蛋白結合按照常規方法制備毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原。
【技術特征摘要】
1. 一種適用于同時分析毒死蜱和甲基對硫磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備，其特征在于，毒死蜱人工半抗原和甲基對硫磷人工半抗原以一定比例與牛血清白蛋白結合制得通用人工抗原，按照常規方法使用新西蘭白兔免疫制備毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體，毒死蜱人工半抗原和甲基對硫磷人工半抗原以一定比例與卵清蛋白結合按照常規方法制備毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原。2. 根據權利要求1的通用毒死蜱人工抗原和甲基對硫磷人工抗原，其特征 在于毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原和牛血清白蛋白通過如下重量 比例反應制備毒死蜱人工半抗...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫家隆，
申請(專利權)人：孫家隆，
類型：發明
國別省市：95[中國|青島]
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