【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及糖肽疫苗和糖蛋白來源多肽聯合聚糖佐劑等組合的研發，具體涉及一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法與多肽疫苗組合。
技術介紹
1、多糖參與了幾乎所有的免疫過程，包括驅動宿主與病原體的相互作用、免疫識別和激活，以及通過一系列復雜的途徑和機制區分自我和非我。復雜型、高甘露糖型、雜合型等糖鏈被相關結合蛋白結合后，可以重新校準免疫反應的強弱、性質和結局，用于自身免疫性疾病和腫瘤的治療。部分乙肝免疫逃逸患者存在異常的n-糖基化變異，與野生型相比，突變株與抗乙肝表面抗原(hbsag)抗體(hbsab)的反應減弱。乙肝病毒亞型d3的變異序列中發現n-糖基化的三種hbsag抗原環的異常突變，使得疫苗和自然感染誘導的hbsab對突變抗原的識別能力嚴重受損。在豬繁殖與呼吸綜合征病毒2型(prrsv-2)中，正選擇壓力作用于可能與免疫逃逸相關的氨基酸位點，通過糖蛋白以屏蔽。傳染性造血壞死病毒(ihnv)的g蛋白是一種囊膜糖蛋白，是ihnv的主要抗原決定簇，438位置上的天冬酰胺殘基(asn,n)糖基化可能在病毒免疫逃逸中起重要作用。在丙型肝炎病毒(hcv)包膜糖蛋白異源二聚體e1e2中，e1上的5個位點和e2上的11個位點均被n-連接的糖鏈修飾，葡聚糖掩蓋了中和抗體針對的抗原部位，而產生免疫逃逸功能，對其表位進行基于結構的設計可以用來調節e2的抗原性。甲型流感病毒(iav)在經歷抗原漂移時，在ha球狀結構域上出現新的n-糖基化基列，保護了氨基酸殘基免受抗體接觸，進而促使病毒的持續傳播。來源于n-和o-糖基化蛋白且該表位中心帶有寡糖的糖肽，可被h
2、n-糖鏈的核心結構[man1-3glcnac2fuc0-1]限制性的聚糖，在哺乳動物組織中很少發現，然而[man2-3glcnac2fuc1]在腫瘤中顯著上調，包括在結直腸癌和肝癌。在進展期結直腸癌中，預后不良與寡甘露糖的高表達相關。基于差異表達的糖基化相關基因和異質性tme所建立的名為glycoscore的預測系統評估熱腫瘤和冷腫瘤時發現，glycoscore較高的患者預后較差。目前國內外基于n-糖基化抗腫瘤的相關研究發現，寡糖轉移酶抑制劑(ngi-1)以寡糖轉移酶(ost)為靶標，抑制寡糖轉移到受體蛋白上，其抗腫瘤機制如，ngi-1阻礙非小細胞癌中的表皮生長因子受體(egfr)糖蛋白在細胞表面的定位和信號傳遞，從而導致細胞周期停滯。針對egfr酪氨酸激酶抑制劑(tki)，如吉非替尼、厄洛替尼或奧希替尼耐藥的細胞，聯合ngi-1可產生合成性致死。無論是否存在t790m?tki耐藥突變，均能抑制ost并破壞egfr?n-糖基化，從而下調受體的活化。腫瘤細胞具有特殊的糖基化模式可以通過免疫細胞表達的凝集素所識別，glcnac、n-乙酰神經氨酸(neuac)、thomsen-friedenreich抗原(tf-ag)和巖藻糖(fuc)與較差的預后相關，而甘露糖(man)和葡萄糖(glc)關聯較好的生存。高甘露糖型和單一glcnac類型的n-聚糖，尤其是man3glcnac2和n-聚糖核心的man3三糖具有高度偏好，可通過甘露糖受體(mr)誘導人dc細胞產生更多活性的hil12p40、hil12p70和hil-10，顯著提高hla-dr、cd40、cd83和cd86的表達水平并降低內吞能力，進而增強抗腫瘤免疫應答。因此，糖基化影響dc的抗原提呈，特定的特殊糖鏈傾向于誘導更強或更弱的t細胞激活。
3、采用ngi-1抑制腫瘤細胞或/與dc細胞的n-糖基化，因其缺乏特異性，可能影響某些特定糖鏈所誘導的抗腫瘤免疫應答的活化，且基于目前國內外針對特異性聚糖鏈修飾蛋白的抗體和特異性聚糖鏈修飾抗原肽的報道甚少(受限于生產制備技術等原因)的背景下，本申請有望解決上述難題，采用一種以糖基化蛋白來源的多肽疫苗組合，發揮有效且強大的特異性抗腫瘤免疫應答效應。
技術實現思路
1、為解決現有技術存在的技術問題或缺陷，本專利技術提出了一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法與多肽疫苗組合，首先建立一系列篩選包含特定糖鏈修飾位點的抗原多肽的流程，虛擬篩選結合體內外試驗優化并驗證多肽序列，增強多肽的親和力和活化ctl的能力，聯合聚糖佐劑和ngi-1等組合，較單抗原、佐劑、ngi-1及其兩兩組合，具有顯著的抗腫瘤免疫作用。
2、為了實現上述目的，本專利技術提出了一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，包括如下步驟：
3、s1、采用液相色譜-質譜聯用分析和鑒定多種腫瘤細胞和正常上皮細胞的n-糖基化修飾蛋白的糖鏈類型與修飾位點，并篩選具有特定糖型修飾的殘基位點；
4、s2、采用dna全外顯子測序和真核生物mrna轉錄組測序檢測特定糖鏈修飾位點的dna突變和mrna轉錄情況，明確位點殘基表達的保守性；
5、s3、采用uniprot、provean等多種數據庫了解蛋白質序列、糖基化修飾位點保守性以及位點突變對蛋白穩定性影響等相關參數，明確包含特定糖型修飾位點(包括n>x突變)的多肽序列；
6、s4、采用netmhcpan4.1等多種數據庫預測hla-i分子與多肽序列(包括n>x突變)的親和力以及b細胞線性表位，明確具有高hla-i預測親和力且包含b細胞線性表位的九肽抗原(包括糖基化位點n>x)；
7、s5、采用虛擬篩選等多種手段，預測hla-i分子與九肽抗原(包括糖基化位點n>x)的結合穩定性等重要參數；并體外合成九肽(包括糖基化位點n>x)；
8、s6、采用elispot驗證步驟s5中所述九肽及其疫苗組合誘導并活化ctl細胞(或與人腫瘤細胞微球共培養)釋放ifn-γ的水平；采用荷瘤小鼠模型體內驗證多肽疫苗組合的抗腫瘤免疫作用。
9、作為優選，步驟s1中所述n-糖基化修飾蛋白的糖鏈類型主要包括hexnac(2)hex(3)fuc(1)。
10、作為優選，步驟s2中所述特定糖鏈修飾位點為n-糖基化修飾蛋白位點，且所述糖基化位點均為保守位點。
11、作為優選，步驟s3中具體采用uniprot了解以apmap蛋白序列的第160位n-糖修飾殘基為中心的前/后各15位的共31個氨基酸殘基組成的兩條多肽序列；
12、所述兩條多肽序列分別為depvcgrplgiragpngtlfvadaykglfev與depvcgrplgiragpsgtlfvadaykglfev(n>s)。
13、作為優選，步驟s4中采用netmhcpan4.1依據親和力預測以發現所述兩條多肽序列中可能被hla-i類分子hla-a*24:02提呈的多肽表位。
14、作為優選，步驟s4中采用iedb進一步預測所述兩條多肽序列是否為b細胞線性表位。
15、作為優選，所述步驟s5中具體采用分子對接和分子動力學模擬的手段預測多肽表位中的n-糖基化位點單殘基突變前后的多肽分子本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟S1中所述N-糖基化修飾蛋白的糖鏈類型主要包括HexNAc(2)Hex(3)Fuc(1)。
3.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟S2中所述特定糖鏈修飾位點為N-糖基化修飾蛋白位點，且所述糖基化位點均為保守位點。
4.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟S3中具體采用UniProt了解以APMAP蛋白序列的第160位N-糖修飾殘基為中心的前/后各15位的共31個氨基酸殘基組成的兩條多肽序列，所述多肽序列為DEPVCGRPLGIRAGPNGTLFVADAYKGLFEV與DEPVCGRPLGIRAGPSGTLFVADAYKGLFEV(N>S)。
5.根據權利要求4所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟S4中采用NetMHCpan4.1依據親和力預測以發現所述兩條多肽序列中可能被HLA-I類分子HLA-A*2
6.根據權利要求5所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟S4中采用IEDB進一步預測所述兩條多肽序列是否為B細胞線性表位。
7.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：所述步驟S5中具體采用分子對接和分子動力學模擬的手段預測多肽表位中的N-糖基化位點單殘基突變前后的多肽分子、甘露寡糖修飾多肽RAGPNGTLF和RAGPSGTLF與HLA-A*24:02類分子相互作用的結合穩定性，以及甘露寡糖修飾APMAP蛋白和N160S突變APMAP蛋白的結合穩定性預測。
8.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟S6中具體通過誘導imDC為mDC疫苗后活化CTL細胞。
9.一種基于權利要求1-8任意一項所述糖基化蛋白來源多肽的篩選方法篩選驗證得到的多肽疫苗組合，其特征在于：由兩組糖基化蛋白來源的九肽疫苗組成；
...【技術特征摘要】
1.一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟s1中所述n-糖基化修飾蛋白的糖鏈類型主要包括hexnac(2)hex(3)fuc(1)。
3.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟s2中所述特定糖鏈修飾位點為n-糖基化修飾蛋白位點，且所述糖基化位點均為保守位點。
4.根據權利要求1所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟s3中具體采用uniprot了解以apmap蛋白序列的第160位n-糖修飾殘基為中心的前/后各15位的共31個氨基酸殘基組成的兩條多肽序列，所述多肽序列為depvcgrplgiragpngtlfvadaykglfev與depvcgrplgiragpsgtlfvadaykglfev(n>s)。
5.根據權利要求4所述的一種糖基化蛋白來源多肽的篩選方法，其特征在于：步驟s4中采用netmhcpan4.1依據...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱影，
申請(專利權)人：中國科學院基礎醫學與腫瘤研究所籌，
類型：發明
國別省市：
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