【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)涉及分子細(xì)胞檢測(cè)，特別是涉及一種基于全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的標(biāo)志物及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、小鼠免疫細(xì)胞的分型是通過檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記分子（標(biāo)志物）的表達(dá)情況和細(xì)胞功能特征來(lái)進(jìn)行的。通過免疫細(xì)胞的分型，可以更加深入地了解小鼠免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。這對(duì)于研究免疫相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制、預(yù)防和治療具有重要意義。免疫細(xì)胞的分型主要依據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)情況來(lái)進(jìn)行，表面標(biāo)記分子是免疫細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白分子，通過與免疫細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，參與免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)。通過采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)，可以標(biāo)記和分析免疫細(xì)胞標(biāo)記分子的表達(dá)情況，從而進(jìn)行免疫細(xì)胞的分型。荷瘤小鼠是癌癥研究中的常用模型，通過免疫細(xì)胞分型，科學(xué)家可以了解腫瘤微環(huán)境的變化，包括免疫細(xì)胞的組成、功能狀態(tài)和動(dòng)態(tài)變化，從而評(píng)價(jià)免疫療法的效果。在藥物開發(fā)階段，通過免疫細(xì)胞分型可以評(píng)估新藥對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，以優(yōu)化藥物組合或確定潛在的副作用；免疫細(xì)胞分型還被用于基礎(chǔ)科學(xué)研究，探索免疫系統(tǒng)的正常功能與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
2、近年來(lái)，用于檢測(cè)小鼠免疫細(xì)胞分型的流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)發(fā)展迅速，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀增加了檢測(cè)通道，可同時(shí)分析更多細(xì)胞表面標(biāo)記，隨著可檢測(cè)參數(shù)數(shù)量的增加，傳統(tǒng)流式儀需要更多的激光器和更復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，從而增加了儀器成本。傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)可受熒光染料穩(wěn)定性及光散射的影響，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性受限，且光譜分辨率有限，對(duì)于某些復(fù)雜或者低豐度的細(xì)胞類型，不夠敏感；傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)在多色染色時(shí)需要精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以避免熒光團(tuán)之間的光譜重疊。熒光團(tuán)之
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于此，有必要提供一種可重復(fù)性好、準(zhǔn)確性和靈敏度高的基于全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的標(biāo)志物及其應(yīng)用。
2、本申請(qǐng)的第一方面，提供了一種基于全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的標(biāo)志物，所述標(biāo)志物包括cd45抗體、cd4抗體、cd8a抗體、cd3抗體、cd11b抗體、cd11c抗體、cd49b抗體、f4/80抗體、cd86抗體、i-a/i-e抗體、cd25抗體、cd62l抗體、cd44抗體和foxp3抗體中的至少一種。
3、本申請(qǐng)通過特定的全光譜流式通道，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)樣本管中同時(shí)檢測(cè)小鼠的11種免疫細(xì)胞類型和占比，減少了不同熒光通道之間的干擾，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，結(jié)果表明利用本申請(qǐng)技術(shù)方案獲得的數(shù)據(jù)的cv值（實(shí)驗(yàn)內(nèi)和實(shí)驗(yàn)間）均小于10%，表示本申請(qǐng)的技術(shù)方案具有較好的重復(fù)性和可靠性。
4、在其中一些實(shí)施例中，各抗體均為熒光素標(biāo)記的抗體。
5、在其中一些實(shí)施例中，所述cd45抗體的熒光素標(biāo)記為apc-fire?750，所述cd4抗體的熒光素標(biāo)記為alexa?flour?700，所述cd8a抗體的熒光素標(biāo)記為percp-cy5.5，所述cd3抗體的熒光素標(biāo)記為fitc，所述cd11b抗體的熒光素標(biāo)記為pe-fire640，所述cd11c抗體的熒光素標(biāo)記為spark?nir?685，所述cd49b抗體的熒光素標(biāo)記為pe-dazzle?594，所述f4/80抗體的熒光素標(biāo)記為bv?421，所述cd86抗體的熒光素標(biāo)記為bv?650，所述i-a/i-e抗體的熒光素標(biāo)記為pe-cy7，所述cd25抗體的熒光素標(biāo)記為apc，所述cd62l抗體的熒光素標(biāo)記為bv785，所述cd44抗體的熒光素標(biāo)記為bv?605，所述foxp3抗體的熒光素標(biāo)記為pe。
6、本申請(qǐng)還提供了上述的標(biāo)志物在制備檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7、本申請(qǐng)還提供一種免疫細(xì)胞分型的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
8、獲取待測(cè)樣本，采用上述的標(biāo)志物進(jìn)行全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析反應(yīng)結(jié)果。
9、在其中一些實(shí)施例中，分析反應(yīng)結(jié)果的步驟包括：根據(jù)所述全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果數(shù)據(jù)，采用逐級(jí)設(shè)門將免疫細(xì)胞分群，圈出目的細(xì)胞群，再分析所述目的細(xì)胞群中，分別與各熒光素標(biāo)記的抗體結(jié)合的抗原的表達(dá)情況。
10、在其中一些實(shí)施例中，所述目的細(xì)胞群包括：第一目的細(xì)胞群為白細(xì)胞；第二目的細(xì)胞群為活細(xì)胞；第三目的細(xì)胞群為去除粘連體的單個(gè)活白細(xì)胞；第四目的細(xì)胞群為表達(dá)cd45的白細(xì)胞；第五目的細(xì)胞群為在所述cd45+的白細(xì)胞中，表達(dá)cd3+的t細(xì)胞；第六目的細(xì)胞群為在所述cd3+的t細(xì)胞中，表達(dá)cd4-和cd8+的cd8+t細(xì)胞；第七目的細(xì)胞群為在所述cd3+的t細(xì)胞中，表達(dá)cd8-和cd4+的cd4+t細(xì)胞；第八目的細(xì)胞群為在所述cd4+t細(xì)胞中，表達(dá)cd25+和foxp3+的調(diào)節(jié)t細(xì)胞；第九目的細(xì)胞群為在所述cd3+的t細(xì)胞中，表達(dá)cd44-和cd62l+的原始t細(xì)胞；第十目的細(xì)胞群為在所述cd3+的t細(xì)胞中，表達(dá)cd44+和cd62l+的中心記憶t細(xì)胞；第十一目的細(xì)胞群為在所述cd3+的t細(xì)胞中，表達(dá)cd44+和cd62l-的效應(yīng)t細(xì)胞；第十二目的細(xì)胞群為在所述cd45+的白細(xì)胞中，表達(dá)cd3-和cd49b+的自然殺傷細(xì)胞；第十三目的細(xì)胞群為在所述cd45+的白細(xì)胞中，表達(dá)cd11b+的髓系細(xì)胞；第十四目的細(xì)胞群為在所述髓系細(xì)胞中，表達(dá)f4-80+的巨噬細(xì)胞；及第十五目的細(xì)胞群為在所述髓系細(xì)胞中，表達(dá)mhc-ⅱ+、cd11c+和cd86+的樹突細(xì)胞。
11、在其中一些實(shí)施例中，所述待測(cè)樣本選自外周血、脾臟和淋巴結(jié)中的至少一種；和/或
12、以所述待測(cè)樣本的體積為基準(zhǔn)，所述cd45抗體的濃度為0.5μg/ml~10μg/ml，所述cd4抗體的濃度為0.625μg/ml?~12.5μg/ml，所述cd8a抗體的濃度為1μg/ml?~40μg/ml，所述cd3抗體的濃度為1.667μg/ml?~50μg/ml，所述cd11b抗體的濃度為0.5μg/ml?~10μg/ml，所述cd11c抗體的濃度為0.556μg/ml?~6.25μg/ml，所述cd49b抗體的濃度為0.286μg/ml?~3.333μg/ml，所述f4/80抗體的濃度為0.5μg/ml~10μg/ml，所述cd86抗體的濃度為0.5μg/ml~10μg/ml，所述i-a/i-e抗體的濃度為0.222μg/ml?~3.333μg/ml，所述cd25抗體的濃本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物包括CD45抗體、CD4抗體、CD8a抗體、CD3抗體、CD11b抗體、CD11c抗體、CD49b抗體、F4/80抗體、CD86抗體、I-A/I-E抗體、CD25抗體、CD62L抗體、CD44抗體和FOXP3抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)志物，其特征在于，各抗體均為熒光素標(biāo)記的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的標(biāo)志物，其特征在于，所述CD45抗體的熒光素標(biāo)記為APC-Fire750，所述CD4抗體的熒光素標(biāo)記為Alexa?Flour?700，所述CD8a抗體的熒光素標(biāo)記為PerCP-Cy5.5，所述CD3抗體的熒光素標(biāo)記為FITC，所述CD11b抗體的熒光素標(biāo)記為PE-Fire640，所述CD11c抗體的熒光素標(biāo)記為Spark?NIR?685，所述CD49b抗體的熒光素標(biāo)記為PE-Dazzle594，所述F4/80抗體的熒光素標(biāo)記為BV?421，所述CD86抗體的熒光素標(biāo)記為BV?650，所述I-A/I-E抗體的熒光素標(biāo)記為PE-Cy7，所述CD25抗體的熒光素標(biāo)記為APC，所述
4.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的標(biāo)志物在制備檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.一種免疫細(xì)胞分型的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫細(xì)胞分型的檢測(cè)方法，其特征在于，分析反應(yīng)結(jié)果的步驟包括：根據(jù)所述全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果數(shù)據(jù)，采用逐級(jí)設(shè)門將免疫細(xì)胞分群，圈出目的細(xì)胞群，再分析所述目的細(xì)胞群中，分別與各熒光素標(biāo)記的抗體結(jié)合的抗原的表達(dá)情況。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫細(xì)胞分型的檢測(cè)方法，其特征在于，所述目的細(xì)胞群包括：第一目的細(xì)胞群為白細(xì)胞；第二目的細(xì)胞群為活細(xì)胞；第三目的細(xì)胞群為去除粘連體的單個(gè)活白細(xì)胞；第四目的細(xì)胞群為表達(dá)CD45的白細(xì)胞；第五目的細(xì)胞群為在所述CD45+的白細(xì)胞中，表達(dá)CD3+的T細(xì)胞；第六目的細(xì)胞群為在所述CD3+的T細(xì)胞中，表達(dá)CD4-和CD8+的CD8+T細(xì)胞；第七目的細(xì)胞群為在所述CD3+的T細(xì)胞中，表達(dá)CD8-和CD4+的CD4+T細(xì)胞；第八目的細(xì)胞群為在所述CD4+T細(xì)胞中，表達(dá)CD25+和Foxp3+的調(diào)節(jié)T細(xì)胞；第九目的細(xì)胞群為在所述CD3+的T細(xì)胞中，表達(dá)CD44-和CD62L+的原始T細(xì)胞；第十目的細(xì)胞群為在所述CD3+的T細(xì)胞中，表達(dá)CD44+和CD62L+的中心記憶T細(xì)胞；第十一目的細(xì)胞群為在所述CD3+的T細(xì)胞中，表達(dá)CD44+和CD62L-的效應(yīng)T細(xì)胞；第十二目的細(xì)胞群為在所述CD45+的白細(xì)胞中，表達(dá)CD3-和CD49b+的自然殺傷細(xì)胞；第十三目的細(xì)胞群為在所述CD45+的白細(xì)胞中表達(dá)CD11b+的髓系細(xì)胞；第十四目的細(xì)胞群為在所述髓系細(xì)胞中，表達(dá)F4-80+的巨噬細(xì)胞；及第十五目的細(xì)胞群為在所述髓系細(xì)胞中，表達(dá)MHC-Ⅱ+、CD11c+和CD86+的樹突細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5~7所述的免疫細(xì)胞分型的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本選自外周血、脾臟和淋巴結(jié)中的至少一種；和/或
9.一種檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的標(biāo)志物或者包含用于檢測(cè)如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述標(biāo)志物的產(chǎn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括紅細(xì)胞裂解素、破膜劑和熒光穩(wěn)定劑。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物包括cd45抗體、cd4抗體、cd8a抗體、cd3抗體、cd11b抗體、cd11c抗體、cd49b抗體、f4/80抗體、cd86抗體、i-a/i-e抗體、cd25抗體、cd62l抗體、cd44抗體和foxp3抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)志物，其特征在于，各抗體均為熒光素標(biāo)記的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的標(biāo)志物，其特征在于，所述cd45抗體的熒光素標(biāo)記為apc-fire750，所述cd4抗體的熒光素標(biāo)記為alexa?flour?700，所述cd8a抗體的熒光素標(biāo)記為percp-cy5.5，所述cd3抗體的熒光素標(biāo)記為fitc，所述cd11b抗體的熒光素標(biāo)記為pe-fire640，所述cd11c抗體的熒光素標(biāo)記為spark?nir?685，所述cd49b抗體的熒光素標(biāo)記為pe-dazzle594，所述f4/80抗體的熒光素標(biāo)記為bv?421，所述cd86抗體的熒光素標(biāo)記為bv?650，所述i-a/i-e抗體的熒光素標(biāo)記為pe-cy7，所述cd25抗體的熒光素標(biāo)記為apc，所述cd62l抗體的熒光素標(biāo)記為bv?785，所述cd44抗體的熒光素標(biāo)記為bv?605，所述foxp3抗體的熒光素標(biāo)記為pe。
4.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的標(biāo)志物在制備檢測(cè)免疫細(xì)胞分型的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.一種免疫細(xì)胞分型的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫細(xì)胞分型的檢測(cè)方法，其特征在于，分析反應(yīng)結(jié)果的步驟包括：根據(jù)所述全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果數(shù)據(jù)，采用逐級(jí)設(shè)門將免疫細(xì)胞分群，圈出目的細(xì)胞群，再分析所述目的細(xì)胞群中，分別與各熒光素標(biāo)記的抗體結(jié)合的抗原的表...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何彩霞，曾思聰，張攀，歐陽(yáng)琦，胡建敏，林戈，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院有限公司，
類型：發(fā)明
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