【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥的，更具體地說，它涉及一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液及其制備方法。
技術(shù)介紹
1、干眼癥是由于淚液的質(zhì)或量或流體動力學(xué)異常，引起淚膜不穩(wěn)定和（或）眼表損害，從而導(dǎo)致眼不適癥狀及視功能障礙的一類疾病；青光眼是一種眼部疾病，其特征是眼壓增高，導(dǎo)致視神經(jīng)損傷和視野缺損。如果不及時治療，青光眼會嚴(yán)重?fù)p害患者的視力，并最終導(dǎo)致失明。
2、干細(xì)胞外泌體可作為一種有效的視神經(jīng)保護(hù)和再生療法，在青光眼中，促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（rgc）存活、抑制神經(jīng)炎癥損害、遞送神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。視網(wǎng)膜神經(jīng)炎癥方面，外泌體抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其相關(guān)的神經(jīng)炎癥、上調(diào)突觸相關(guān)蛋白和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)。此外，外泌體還包含多種生長因子，可以調(diào)節(jié)眼部微環(huán)境，減少房水的產(chǎn)生或增加房水的排除，從而降低眼內(nèi)壓。在干眼病中，干細(xì)胞外泌體促進(jìn)角膜損傷的無瘢痕修復(fù)，減輕基質(zhì)混濁，有利于維持角膜的透明性。
3、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bfgf）是一種分布于多種組織中參與細(xì)胞增殖與分化等多種生理過程的生長因子，主要應(yīng)用于創(chuàng)傷組織的修復(fù)和再生，對于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞有明顯的促進(jìn)有絲分裂作用，bfgf還能夠?qū)I膜和角膜上皮結(jié)構(gòu)的增生和分裂進(jìn)行有效的促進(jìn)，同時減輕干眼癥狀、減少輕度角膜上皮損害和促進(jìn)淚膜質(zhì)量改變。然而，常見的bfgf相關(guān)眼科藥物多數(shù)為原核及酵母系統(tǒng)表達(dá)，導(dǎo)致bfgf分離純化成本高，蛋白不穩(wěn)定且不易保存。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本專利技術(shù)的目的在于
2、本專利技術(shù)的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的，一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，包括以下步驟：
3、s1、復(fù)蘇p6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，使用bfgf基因修飾的慢病毒載體感染，換液，培養(yǎng)獲得外泌體原液；
4、s2、對所述外泌體原液超濾濃縮，使用生理鹽水置換，獲得bfgf外泌體濃縮液；
5、s3、使用生理鹽水分別溶解牛磺酸、維生素b、羥丙甲纖維素和卡波姆，混合均勻，獲得第一混合液；
6、s4、將所述bfgf外泌體濃縮液加入至所述第一混合液中，使用生理鹽水定容，攪拌均勻，過濾、分裝及密封，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
7、在其中一個實(shí)施例中，所述s1還包括：
8、s11、對所述p6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞水浴復(fù)蘇，加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)所述p6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至生長狀態(tài)為80%；
9、s12、按moi=25加入所述bfgf基因修飾的慢病毒載體，感染24h，換液；
10、s13、加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，獲得所述外泌體原液。
11、在其中一個實(shí)施例中，所述s11的具體步驟為：水浴融化所述p6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，500g離心5min，去除上清，加入培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
12、在其中一個實(shí)施例中，所述s12還包括：
13、s121、取用s11培養(yǎng)后的p6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按moi=25加入所述bfgf基因修飾的慢病毒載體，并加入助感染劑，混勻，500g離心60min，后置入co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
14、s122、加入胰酶，靜置，加入培養(yǎng)基終止消化，500g離心5min，去除上清，加入培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
15、在其中一個實(shí)施例中，所述s2中對所述外泌體原液超濾濃縮的具體步驟為：使用200cm2的孔徑為100kd切向流超濾膜包，以流速30ml/min對所述外泌體原液超濾濃縮5倍。
16、在其中一個實(shí)施例中，所述生理鹽水為注射用生理鹽水，所述注射用生理鹽水的滲透壓為260-340mosm/l。
17、一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液，由上述bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法制備而成。
18、在其中一個實(shí)施例中，bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液包括以下濃度組分：bfgf外泌體濃縮液80-120ml/l、牛磺酸1.5-2.5g/l、維生素b?80-120mg/l、羥丙甲纖維素0.1-0.2g/l、卡波姆1-2g/l，溶劑為生理鹽水。
19、上述一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液及其制備方法，具有以下有益效果：
20、其一，通過使用bfgf基因修飾的慢病毒載體感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，改良bfgf藥物劑型，使其更為穩(wěn)定，并將使用生理鹽水置換后的外泌體濃縮液用于制備滴眼液，有助于修復(fù)受損視覺神經(jīng)細(xì)胞，改善癥狀，緩解干眼癥及青光眼所帶來的不適；
21、其二，不含防腐劑，避免防腐劑損傷眼角膜細(xì)胞，成品安全溫和；
22、其三，使用注射用生理鹽水作為溶液，無需另外調(diào)節(jié)滲透壓，且制備工藝簡單，可操作性強(qiáng)，易于推廣，具有良好的應(yīng)用前景及潛在的經(jīng)濟(jì)效益。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種bFGF基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種bFGF基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述S1還包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種bFGF基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述S11的具體步驟為：水浴融化所述P6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，500g離心5min，去除上清，加入培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種bFGF基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述S12還包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種bFGF基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述S2中對所述外泌體原液超濾濃縮的具體步驟為：使用200cm2的孔徑為100KD切向流超濾膜包，以流速30ml/min對所述外泌體原液超濾濃縮5倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種bFGF基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于：所述生理鹽水為注射用生理鹽水，所述注射用生理鹽水的滲透壓為260-340mOsm/L。<...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述s1還包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述s11的具體步驟為：水浴融化所述p6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，500g離心5min，去除上清，加入培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述s12還包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種bfgf基因修飾的干細(xì)胞外泌體滴眼液的制備方法，其特征在于，所述s2中對所述外泌體原液超濾濃縮的具體步驟為：使用2...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：杜永彪，安鴻，鐘浩，李增寶，
申請(專利權(quán))人：康儲科技廣東有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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