【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種同時檢測多種病原微生物及耐藥基因的多重熒光pcr試劑盒及方法。
技術介紹
1、全球感染性疾病的發病率有所上升，病原體類型呈現多樣化和復雜化的發展趨勢。對應治療抗生素的普遍濫用，導致細菌通過基因或染色體突變，產生了細菌耐藥性，使得多種感染性疾病可能沒有合適的抗生素去治療，會對人類健康造成巨大的威脅。
2、耐藥基因：是編碼微生物耐藥性狀的一段核苷酸序列，與其他遺傳物質一樣，可在細菌分裂增殖過程中得到復制，導致微生物對相應抗生素產生耐藥性。
3、熒光pcr：在pcr擴增反應體系中引入熒光報告基團，隨著每一輪pcr反應的進行，熒光報告基團發出的熒光信號會不斷累積，通過儀器監測熒光信號的變化，即可對pcr反應過程進行實時監測。
4、多重熒光pcr：即在熒光pcr的基礎上，在同一個反應體系內引入多個可區分的熒光報告基團，通過監測不同熒光信號的變化情況，即可對多個pcr反應過程進行同時監測，達到同時檢測多個靶標的目的。
5、目前熒光pcr試劑盒，檢測靶標數量較少，無法提示病原微生物的相關耐藥信息，無法滿足臨床檢測需求。具體的，基本僅檢測病原體核酸，不涉及耐藥基因的檢測，在一次檢測中無法提示病原微生物的相關耐藥信息；檢測單一靶標的熒光pcr試劑盒，例如人巨細胞病毒熒光pcr檢測試劑盒，僅能檢測待測樣本中是否存在人巨細胞病毒的核酸，而對于其他病毒，例如呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒，均無法檢測。導致臨床上如果使用該類型熒光pcr試劑盒進行感染病原體鑒定，需要做多次檢測，
技術實現思路
1、有鑒于現有技術的上述缺陷，本專利技術提供了一種同時檢測多種病原微生物及耐藥基因的多重熒光pcr試劑盒，基于多色熒光通道，對目標內病原微生物及耐藥基因的特異性保守區域分別進行pcr擴增，利用多個熒光通道分別標記對應檢測靶標，對不同靶標的擴增情況進行監測，可實現在一次上機過程中同時檢測幾十種病原體及耐藥基因，并且準確性高、特異性強、靈敏度高、快速且結果可靠。
2、基于生信分析結果，將不會發生非特異交叉擴增的4對引物及熒光探針組合到一起。最終形成24個組合，每個組合檢測4種靶標，總共可檢測96種病原體及耐藥基因，所獲得的樣本病原體信息量大大增加。
3、本專利技術提供了一種同時檢測多種病原微生物及耐藥基因的多重熒光pcr試劑盒：包括用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針、pcr反應預混液、陽性質控品、陰性質控品。
4、優選的，所述目標病原微生物及耐藥基因包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、肺支耐藥、肺炎支原體、鳥分枝桿菌復合群、嗜麥芽窄食單胞菌、嗜肺軍團菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、eb病毒、煙曲霉、黃曲霉、人巨細胞病毒、甲型流感病毒、白色念珠菌、熱帶念珠菌、惠普爾養障體、人博卡病毒、結核分枝桿菌、新型冠狀病毒、乙型流感病毒、人偏肺病毒、鸚鵡熱衣原體、鼻病毒、內參基因、呼吸道合胞病毒、單核細胞增多李斯特菌、化膿鏈球菌、無乳鏈球菌、龜分枝桿菌、星狀諾卡氏菌、具核梭桿菌、恙蟲病東方體、漢塞巴爾通體、鼻疽伯克霍爾德菌、腦膜炎奈瑟菌、腸道沙門氏菌、奇異變形桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、粘質沙雷氏菌、產氣克雷伯菌、鼻疽諾卡氏菌、黑曲霉、土曲霉、羊布魯氏菌、摩氏摩根菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、人型支原體、沙眼衣原體、克柔念珠菌、都柏林念珠菌、肺炎衣原體、梅毒螺旋體、新型隱球菌、阿薩希毛孢子菌、脆弱擬桿菌、布魯氏菌屬、馬爾尼菲籃狀菌、耶氏肺孢子菌、百日咳桿菌、嗜水氣單胞菌、小孢根霉、鐮刀菌屬、弗氏檸檬酸桿菌、豚鼠耳炎諾卡氏菌、人皰疹病毒1型、人皰疹病毒2型、人皰疹病毒3型(vzv)、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒7型、豬鏈球菌、胞內分枝桿菌、蓋爾森基興諾卡氏菌、腺病毒3型、腺病毒4型、腺病毒7型、腺病毒21型、漢坦病毒、meca、bla?kpc、ndm、oxa-48、vim、imp、vana、ampc、oxa-23、shv、mcr-1；
5、優選的，所述目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針的上游引物序列、下游引物序列及熒光探針的核酸序列如下：
6、用于檢查金黃色葡萄球菌，上游引物的核酸序列：ggcggcggcctaata；下游引物的核酸序列：ctaacatcagaaagcaagc；熒光探針的核酸序列：gcaagtcgagcaacggacgag；
7、用于檢查肺炎鏈球菌，上游引物的核酸序列：cttatgggccaagtcta；下游引物的核酸序列：aagcttcaagcagcctcta；熒光探針的核酸序列：aagttggaaaccacgagtaagagtgatga；
8、用于檢查糞腸球菌，上游引物的核酸序列：atgcccgcttcattta；下游引物的核酸序列：ttcttgtatttttcacatcaa；熒光探針的核酸序列：accaaatcggcgaacaacgtctg；
9、用于檢查屎腸球菌，上游引物的核酸序列：gatcaagatcttgtcgtgctt；下游引物的核酸序列：tgatccttataacagcgttt；熒光探針的核酸序列：aagaaccaattcgtcaatcgctg；
10、用于檢查肺支耐藥；上游引物的核酸序列：aaccaggacggggaagaca；下游引物的核酸序列：ttcctacctattctctcatgtaatg；熒光探針的核酸序列：aacggacggaagac；
11、用于檢查肺炎支原體，上游引物的核酸序列：gcacaccaatgccatca；下游引物的核酸序列：gaggggaaaagccgtgtt；熒光探針的核酸序列：cgcgcttaacccgtgaacg；
12、用于檢查鳥分枝桿菌復合群，上游引物的核酸序列：catcggagccgagaag；下游引物的核酸序列：gatcaatgtcggttgac；熒光探針的核酸序列：actgggagctgcgattgc；
13、用于檢查嗜麥芽窄食單胞菌，上游引物的核酸序列：gccaaagcccaagttt；下游引物的核酸序列：cgctttcgtcctcgctta；熒光探針的核酸序列：cgcaagttaatcggccagg；
14、用于檢查嗜肺軍團菌，上游引物的核酸序列：tgccaagggtttgaatacaa；下游引物的核酸序列：ttcgacaggactgtatcattt；熒光探針的核酸序列：aatcaactggaaatggtgttacccgg；
15、用于檢查卡他莫拉菌，上游引物的核酸序列：ggtggtgccgcttttacac；下游引物的核酸序列：tgtcgcctgccaagcaa；熒光探針的核酸序列：tgcttgcagctgttagccactaag
本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種同時檢測多種病原微生物及耐藥基因的多重熒光PCR試劑盒，其特征在于：包括用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針、PCR反應預混液、陽性質控品、陰性質控品；
2.如權利要求1所述的多重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針的包裝規格為192μL*24管檢測管；所述PCR反應預混液的包裝規格為1000μL*6管檢測管；所述陽性質控品的包裝規格為1000μL*3管檢測管；所述陰性質控品的包裝規格為1000μL*3管檢測管。
3.如權利要求2所述的多重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針的24管檢測管為3列8聯管，分別用于檢測：
4.如權利要求1或2所述的多重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述PCR反應預混液包括緩沖液、鎂離子、鉀離子、硫酸銨、甘油、dNTP、dUTP、逆轉錄酶、耐高溫Taq?DNA聚合酶、UDG酶；所述的陰性質控品為無核酸酶水。
5.如權利要求1或2所述的多重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述PCR反應預混液還包括聚
6.如權利要求5所述的多重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述聚乙烯醇-聚賴氨酸聚合物的制備方法包括以下步驟，按重量份計：
7.如權利要求5所述的多重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述海藻糖聚合物的制備方法包括以下步驟，按重量份計：
8.一種如權利要求1-7任一項所述的同時檢測多種病原微生物及耐藥基因的多重熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
9.如權利要求8所述的所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中多重熒光PCR反應液包括4μL?PCR反應預混液、4μL引物及熒光探針、10μLddH2O和2μL核酸模板，反應總體系20μL。
...【技術特征摘要】
1.一種同時檢測多種病原微生物及耐藥基因的多重熒光pcr試劑盒，其特征在于：包括用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針、pcr反應預混液、陽性質控品、陰性質控品；
2.如權利要求1所述的多重熒光pcr試劑盒，其特征在于：所述用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針的包裝規格為192μl*24管檢測管；所述pcr反應預混液的包裝規格為1000μl*6管檢測管；所述陽性質控品的包裝規格為1000μl*3管檢測管；所述陰性質控品的包裝規格為1000μl*3管檢測管。
3.如權利要求2所述的多重熒光pcr試劑盒，其特征在于：所述用于檢測目標病原微生物及耐藥基因的引物及熒光探針的24管檢測管為3列8聯管，分別用于檢測：
4.如權利要求1或2所述的多重熒光pcr試劑盒，其特征在于：所述pcr反應預混液包括緩沖液、鎂離子、鉀離子、硫酸銨、甘油、dntp、dutp、逆轉錄酶、耐高溫...
【專利技術屬性】
技術研發人員：宋銀森，李冬青，馮睿婷，楊珍珍，高娜，
申請(專利權)人：鄭州人民醫院鄭州人民醫院醫療管理中心，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。