【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子檢測，尤其涉及一種特異擴增長林小蠹的組合物及用其檢測或鑒定長林小蠹的方法。
技術介紹
1、長林小蠹在分類上屬于小蠹科，林小蠹屬(hylurgus)，是一種重要的林木害蟲。長林小蠹的首要寄主為赤松(pinus?sylvestris)，次要寄主包括濕地松(p.eliotti)、輻射松(p.radiata)、落葉松屬(larixspp.)等，其在世界多地均有分布。由于其生態及經濟重要性，開展針對長林小蠹的檢測鑒定工作對預防物種入侵、監測種群數量及動態變化，最終實現目標物種的有效防控具有重要意義。
2、目前，針對長林小蠹的檢測鑒定方法主要為形態鑒定方法，輔助以分子條形碼鑒定技術。形態鑒定方法高度依賴檢測人員的專業背景及工作經驗。針對親緣關系較近的物種，形態鑒定方法的準確度亟待提高。而分子條形碼鑒定技術的操作周期長，平均一個樣品需要3個工作日，且檢測過程需要pcr儀等，不適宜口岸等非實驗室場所。
3、如何開發一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、操作方法簡單、檢測耗時短的長林小蠹的檢測鑒定方法，成為本領域亟需解決的技術難題。
技術實現思路
1、為實現上述目的，本專利技術首先提供了一種特異擴增長林小蠹的組合物，包括特異擴增長林小蠹靶標dna片段的引物對和識別長林小蠹靶標dna片段的rna探針；
2、所述引物對由引物3-hy-f3和引物3-hy-r2組成；所述引物3-hy-f3的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述引物3-hy-r2的
3、所述rna探針為探針3-hy-rna5，所述探針3-hy-rna5的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
4、本專利技術通過對引物對和rna探針的組合篩選，獲得了擴增效果極好的引物探針組合物。該組合物對長林小蠹的特異性好，實際樣品檢測效果好，靈敏度高，準確度高。
5、優選地，所述rna探針的5’端標記報告基團，3’端標記猝滅基團。
6、優選地，所述報告基團為fam，猝滅基團為bhq1。
7、優選地，所述長林小蠹靶標dna片段如seq?id?no.4所示。
8、該靶標dna片段為長林小蠹iap2基因序列，genbank登錄號：mf771792.1。
9、優選地，所述引物3-hy-f3的核苷酸序列中含有t7啟動子序列。
10、進一步，本專利技術提供了上述任一實施方案中的組合物在檢測或鑒定長林小蠹中的應用。
11、進一步，本專利技術提供了一種檢測或鑒定長林小蠹的方法，包括：將dna模板、dna重組酶、堿性磷酸酶、t7?rna聚合酶、逆轉錄酶、信號放大酶、上述任一實施方案中的組合物、核苷三磷酸和激活液混合，然后進行等溫擴增。
12、優選地，所述激活液中包括tris，乙酸鎂和peg3000。
13、本專利技術檢測或鑒定長林小蠹的方法利用長林小蠹酶介導雙重指數擴增核酸檢測技術，檢測原理如下：
14、上機后溶劑內熒光產生步驟主要分為三步進行，分別為dna擴增、dna轉錄為rna、rna探針水解產生信號。dna擴增步驟：重組酶與dna引物結合，在溶液中搜尋同源序列，在搜索到同源序列后，侵入dna雙鏈形成d-loop結構，引物被sap聚合酶延伸產生新鏈。該過程反復進行，完成dna復制。dna轉錄成rna：dna擴增中，有一條引物帶有t7啟動子。帶有t7啟動子的擴增產物，在t7rna聚合酶的催化下，高效轉錄生產rna單鏈。rna探針被水解生成信號：rna探針與rna單鏈結合后，被信號放大酶特異性水解，探針兩端的熒光基團與淬滅基團分離后產生熒光信號。結合的rna探針水解后，與rna探針結合穩定性降低。溶液中的rna探針與rna再次結合，并被信號放大酶水解，并再次產生熒光信號。
15、優選地，堿性磷酸酶為蝦堿性磷酸酶。
16、優選地，所述信號放大酶為雙鏈特異性核酸酶。
17、優選地，dna重組酶、堿性磷酸酶、t7?rna聚合酶、逆轉錄酶、信號放大酶以及核苷三磷酸和激活液組分采用蘇州晶睿生物科技有限公司，貨號為rr032的基礎熒光恒溫擴增檢測試劑盒中的組分。
18、優選地，所述等溫擴增的溫度為40℃～45℃，最優選為42℃。
19、優選地，所述等溫擴增時1min為一個循環，總共進行25～40個循環；更優選為25～35個循環；最優選為30個循環。
20、在所述方法中，若等溫擴增后無ct值則判定檢測結果為陰性，若有ct值且ct值小于等于25則判定檢測結果為陽性；若有ct值出現，ct值越小則dna濃度越高。
21、與現有技術相比，本專利技術的有益效果在于：
22、本專利技術開發了一種具有高靈敏度(靈敏度為20μl反應體系中總dna含量9*10-7ng)、高特異性、高準確度、操作方法簡單的長林小蠹的檢測鑒定方法，該方法的檢測時間短，適合長林小蠹在口岸等非實驗室場所的快速檢測，具有極大的推廣應用價值。
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1.一種特異擴增長林小蠹的組合物，其特征在于，包括：特異擴增長林小蠹靶標DNA片段的引物對和識別長林小蠹靶標DNA片段的RNA探針；
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述RNA探針的5’端標記報告基團，3’端標記猝滅基團。
3.根據權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述報告基團為FAM，猝滅基團為BHQ1。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述長林小蠹靶標DNA片段如SEQIDNo.4所示。
5.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述引物3-HY-F3的核苷酸序列中含有T7啟動子序列。
6.權利要求1～5中任一項所述的組合物在檢測或鑒定長林小蠹中的應用。
7.一種檢測或鑒定長林小蠹的方法，其特征在于，包括：將DNA模板、DNA重組酶、堿性磷酸酶、T7?RNA聚合酶、逆轉錄酶、信號放大酶、權利要求1～5中任一項所述的組合物、核苷三磷酸和激活液混合，然后進行等溫擴增。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述等溫擴增的溫度為40℃～45℃，優選為42℃。
<...【技術特征摘要】
1.一種特異擴增長林小蠹的組合物，其特征在于，包括：特異擴增長林小蠹靶標dna片段的引物對和識別長林小蠹靶標dna片段的rna探針；
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述rna探針的5’端標記報告基團，3’端標記猝滅基團。
3.根據權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述報告基團為fam，猝滅基團為bhq1。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述長林小蠹靶標dna片段如seqidno.4所示。
5.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述引物3-hy-f3的核苷酸序列中含有t7啟動子序列。
6.權利要求1～5中任一項所述的組合物在檢測或鑒定長林小蠹中的應用。
7.一種檢測或鑒...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王佳瑩，段維軍，崔俊霞，劉麗，顏書怡，
申請(專利權)人：寧波海關技術中心，
類型：發明
國別省市：
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