【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及納米孔測序，具體地，涉及一種逆轉錄引物及其在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用。
技術介紹
1、隨著高通量測序技術的推廣以及測序成本的下降。高通量測序技術在微生物發現、病原微生物診斷等領域取得了長足的發展。由nanopore公司(即oxford?nanoporetechnologies)研發的納米孔測序技術是最近十年間興起的一種新的高通量測序技術，被稱為第三代測序技術。相比二代測序技術，納米孔測序技術在測序過程中不依賴pcr與簇生成，是一種單分子、長讀長測序技術，同時序列數據在測序反應開始后會立刻得到測序數據，無需等待測序反應完成，具有“隨測隨檢”的特性。這些特性都為納米孔測序帶來了更加廣闊的應用前景。
2、目前，nanopore公司沒有開放其測序儀的技術細節，也無第三方推出適配的納米孔測序文庫構建試劑盒，所以用戶必須使用nanopore公司官方的文庫構建試劑盒進行文庫構建與測序。nanopore公司官方配套的sqk-rpb114.24文庫構建試劑盒可以對低濃度dna核酸進行文庫構建。首先使用轉座酶對雙鏈dna進行酶切與接頭連接，隨后使用試劑盒中的標簽引物對樣本進行pcr擴增，最后對pcr產物進行純化后得到測序文庫。但是該方法需要兩次dna片段純化與定量操作，較為費時，并且轉座酶對dna的切割也導致使用該方法構建的測序文庫長度較短，平均長度不會超過1kb，無法充分發揮納米孔測序長讀長的技術優勢。
3、rna病毒是引起人類及其它動物急性傳染病的重要病原體，目前，利用高通量測序檢測rna
技術實現思路
1、為了解決現有技術中nanopore公司的官方文庫構建試劑盒操作步驟復雜、耗時長、文庫片段偏短以及無法直接構建rna病毒的納米孔測序文庫的問題，本專利技術提供了一種逆轉錄引物及其在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用。
2、本專利技術的第一個目的是提供一種逆轉錄引物。
3、本專利技術的第二個目的是提供所述逆轉錄引物在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用。
4、本專利技術的第三個目的是提供所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用。
5、本專利技術的第四個目的是提供所述逆轉錄引物在rna病毒納米孔高通量測序中的應用。
6、本專利技術的第五個目的是提供所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在rna病毒納米孔高通量測序中的應用。
7、本專利技術的第六個目的是提供所述逆轉錄引物在制備rna病毒納米孔高通量測序文庫構建的產品中的應用。
8、本專利技術的第七個目的是提供所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在制備rna病毒納米孔高通量測序的產品中的應用。
9、本專利技術的第八個目的是提供一種rna病毒的納米孔高通量測序文庫的構建方法。
10、本專利技術的第九個目的是提供所述構建方法在rna病毒納米孔高通量測序中的應用。
11、為了實現上述目的，本專利技術是通過以下方案予以實現的：
12、本專利技術通過在隨機引物上添加固定序列構建了一條新的逆轉錄引物，從rna核酸開始，將先病毒rna逆轉錄為cdna，經過逆轉錄與第二鏈合成反應，使二鏈合成產物可以與nanopore公司的sqk-rpb114.24試劑盒自帶的標簽引物結合進行pcr反應，實現快速構建文庫。
13、本專利技術請求保護以下內容：
14、一種逆轉錄引物，其核苷酸序列如seq?id?no.1～6任一所示。
15、優選地，所述逆轉錄引物的核苷酸序列如seq?id?no.1或2所示。
16、更優選地，所述逆轉錄引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
17、所述逆轉錄引物在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用。
18、所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用，所述文庫構建試劑盒為sqk-rpb114.24試劑盒。
19、所述逆轉錄引物在rna病毒納米孔高通量測序中的應用。
20、所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在rna病毒納米孔高通量測序中的應用，所述文庫構建試劑盒為nanopore公司的sqk-rpb114.24試劑盒。
21、所述逆轉錄引物在制備rna病毒納米孔高通量測序文庫構建的產品中的應用。
22、所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在制備rna病毒納米孔高通量測序的產品中的應用，所述文庫構建試劑盒為nanopore公司的sqk-rpb114.24試劑盒。
23、優選地，所述rna病毒為新型冠狀病毒、流感病毒、登革熱病毒或諾如病毒中的任意一種或幾種。
24、一種rna病毒的納米孔高通量測序文庫的構建方法，包括以下步驟：
25、s1.用待測樣本的核酸與核苷酸序列如seq?id?no.1～6任一所示的逆轉錄引物進行逆轉錄反應，得到cdna；
26、s2.以步驟s1所得cdna為模板，合成所述cdna的第二鏈；
27、s3.以步驟s1所得的合成產物為模板，用文庫構建試劑盒中的標簽引物進行pcr反應，得到納米孔高通量測序文庫；所述文庫構建試劑盒為nanopore公司的sqk-rpb114.24試劑盒。
28、本專利技術所述待測樣本包括但不限于咽拭子、肛拭子、外周血、肺泡灌洗液等常規離體生物樣本。
29、優選地，所述待測樣本為咽拭子、肛拭子、血清或病毒培養物。
30、優選地，步驟s1中，所述逆轉錄引物的核苷酸序列如seq?id?no.1或2所示。
31、更優選地，步驟s1中，所述逆轉錄引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
32、優選地，步驟s2中，將步驟s1所得cdna先去除基因組dna后，再合成其第二鏈。
33、優選地，步驟s3中，還對所述pcr反應所得的產物進行純化。
34、更優選地，所述純化的方法包括磁珠法。
35、更優選地，步驟s3中，還對所得的純化產物進行定量，即測定純化產物的dna含量。
36、進一步優選地，步驟s3中，還將所有待測樣本的所述純化產物進行等質量混合，直至所述納米孔高通量測序文庫的dna含量為：每11μl含400ng～800ng?dna。
37、更進一步優選地，步驟s3中，還將所有待測樣本的所述純化產物進行等質量混合，直至所述納米本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種逆轉錄引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～6任一所示。
2.權利要求1所述逆轉錄引物在RNA病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用。
3.權利要求1所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在RNA病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用，其特征在于，所述文庫構建試劑盒為Nanopore公司的SQK-RPB114.24試劑盒。
4.權利要求1所述逆轉錄引物在RNA病毒納米孔高通量測序中的應用。
5.權利要求1所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在RNA病毒納米孔高通量測序中的應用，其特征在于，所述文庫構建試劑盒為Nanopore公司的SQK-RPB114.24試劑盒。
6.權利要求1所述逆轉錄引物在制備RNA病毒納米孔高通量測序文庫構建的產品中的應用。
7.權利要求1所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在制備RNA病毒納米孔高通量測序的產品中的應用，其特征在于，所述文庫構建試劑盒為Nanopore公司的SQK-RPB114.24試劑盒。
8.根據權利要求2～7任一項所述應用，其特征在于，所述RNA病
9.一種RNA病毒的納米孔高通量測序文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.權利要求9所述構建方法在RNA病毒納米孔高通量測序中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種逆轉錄引物，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.1～6任一所示。
2.權利要求1所述逆轉錄引物在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用。
3.權利要求1所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在rna病毒納米孔高通量測序文庫構建中的應用，其特征在于，所述文庫構建試劑盒為nanopore公司的sqk-rpb114.24試劑盒。
4.權利要求1所述逆轉錄引物在rna病毒納米孔高通量測序中的應用。
5.權利要求1所述逆轉錄引物與文庫構建試劑盒在rna病毒納米孔高通量測序中的應用，其特征在于，所述文庫構建試劑盒為nanopore公司的sqk-rpb114.24...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉哲，易麗娜，彭曉放，陸靖，陳梅芳，
申請(專利權)人：廣東省公共衛生研究院，
類型：發明
國別省市：
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