【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物工程，具體涉及一種茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法。
技術(shù)介紹
1、茶輪斑病在茶園中是一種比較常見的病害。該病害嚴(yán)重時會導(dǎo)致茶樹葉片大量的脫落，還能導(dǎo)致枯梢，以致于茶樹的樹勢衰弱，茶葉產(chǎn)量下降。該病害可以危害葉片和新梢，較多是發(fā)生在成葉和老葉上。染病初期出現(xiàn)黃綠色的小斑點，從葉尖或者葉緣的位置先出現(xiàn)，隨后染病位置慢慢擴(kuò)展成褐色的半圓形、圓形或者不規(guī)則形，并表現(xiàn)出比較明顯的同心輪紋，到最后在染病部位的中間位置會變成灰白色，病斑的最外面會有一圈褐色的隆起線，病害部分與無病害部分有明顯的分界，產(chǎn)生黑色的小粒點在病斑上呈輪紋排列，也就是病原菌的子實體。嫩葉染病時，病斑不一，由葉尖向葉緣逐漸變成黑褐色，呈現(xiàn)出焦枯狀，無輪紋，生有煤狀的小污點，嚴(yán)重時葉片會呈現(xiàn)出一大片的褐色枯斑。另外若是新梢染病，則頂端先發(fā)病，逐漸擴(kuò)展后變成黑色，最終導(dǎo)致整枝枯死。
2、目前已有一些關(guān)于茶輪斑病病原菌鑒定的研究報道，如李應(yīng)祥等從形態(tài)鑒定、致病性鑒定以及分子方面研究發(fā)現(xiàn)貴州都勻的茶區(qū)中茶輪斑病的病原菌是p.theae。zhang等在云南的茶輪斑病中研究發(fā)現(xiàn)一種新的病原為p.furcata。李冬雪等對發(fā)生在貴州惠水縣茶區(qū)的輪斑病葉片進(jìn)行分離、培養(yǎng)、純化等，通過分析其致病性、形態(tài)以及基因系統(tǒng)發(fā)育，發(fā)現(xiàn)其惠水縣引起茶輪斑病病害的病原菌是茶假擬盤多毛孢。chen等通過研究鑒定茶輪斑病的病原，得到的病原結(jié)果中有山茶花擬盤多毛孢、茶假擬盤多毛孢(ps.camelliae-sinensis)和新擬盤多毛孢(neopestalotiopsis?cl
3、茶樹的病害是一定條件下病菌與茶樹互相斗爭的結(jié)果。但截至目前，關(guān)于茶樹的茶輪斑病的互作研究較少，對茶輪斑病菌的基因組測序暫時尚無有關(guān)報道，其功能基因和侵染機(jī)制的尚未明確，防治并沒有系統(tǒng)的深入研究，但是作為茶園中一種常見的、在我國普遍存在的病害，茶輪斑病從根本上治療，缺乏基因功能的鑒定，對病原菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化對于某些基因的功能研究意義重大，因此茶輪斑病原菌原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化方法的研究顯的尤為重要。大多數(shù)真菌在制備原生質(zhì)體時采用的是cm培養(yǎng)基，制備茶輪斑病原菌原生質(zhì)體時使用cm培養(yǎng)基會出現(xiàn)菌絲抱團(tuán)嚴(yán)重，而抱團(tuán)的菌絲會嚴(yán)重的影響到酶解效率。為此，本專利技術(shù)提供一種茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了一種茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，有效解決了制備茶輪斑病菌原生質(zhì)體采用cm培養(yǎng)基導(dǎo)致菌絲抱團(tuán)嚴(yán)重，影響酶解效率，從而導(dǎo)致原生質(zhì)體質(zhì)量不佳的技術(shù)問題，同時構(gòu)建了一種基于peg-ca2+介導(dǎo)的茶輪斑病原菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系，為茶輪斑病原菌的遺傳轉(zhuǎn)化和功能研究奠定了基礎(chǔ)，為茶輪斑病的防治提供了新的方向。
2、本專利技術(shù)的第一個目的是提供一種茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，包括以下步驟：
3、以茶輪斑病菌浸染的病變?nèi)~片為原料，制備得到茶輪斑病菌培養(yǎng)液；
4、取茶輪斑病菌培養(yǎng)液培養(yǎng)得到菌絲體，向所述菌絲體中加入溶壁酶液，得到裂解液，除雜，得到原生質(zhì)體；
5、向所述原生質(zhì)體加入帶有綠色熒光基因的質(zhì)粒，混勻，加入含有聚乙二醇和鈣離子的緩沖液，混勻，再加入pd培養(yǎng)基，于25～28℃搖床培養(yǎng)，利用peg-ca2+介導(dǎo)法將帶有綠色熒光基因的質(zhì)粒導(dǎo)入所述原生質(zhì)體中，加入含抗生素的pda培養(yǎng)基，于25～28℃，3500～4500lux光照培養(yǎng)，得到再生原生質(zhì)體。
6、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述含有聚乙二醇和鈣離子的緩沖液為由400g/lpeg3350、1.2m山梨醇、50mm?ph為8.0的tris-hcl和50mm?cacl2混合，抽濾除菌所得。
7、作為一種優(yōu)選的實施方式，以原生質(zhì)體的濃度5×(107～108)個/ml計，所述含有聚乙二醇和鈣離子的緩沖液分2次加入，每次加入2ml。
8、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述原生質(zhì)體與質(zhì)粒的體積配比為8～10:1。
9、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述原生質(zhì)體與pd培養(yǎng)基的體積比為1:20～30。
10、作為一種優(yōu)選的實施方式，加入含抗生素的pda培養(yǎng)基具體為：加入含抗生素ⅰ的pda培養(yǎng)基，混勻，凝固，再加入含抗生素ⅱ的pda培養(yǎng)基。
11、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述抗生素ⅰ為0.05g/l氯嘧磺隆和0.2g/l新霉素，抗生素ⅱ為0.1g/l氯嘧磺隆和0.4g/l新霉素配制而成；所述含抗生素ⅰ的pda培養(yǎng)基中，所述pda培養(yǎng)基與抗生素ⅰ的體積比為1000:1～2；所述含抗生素ⅱ的pda培養(yǎng)基中，所述pda培養(yǎng)基與抗生素ⅱ的體積比為1000:1～2。
12、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述茶輪斑病菌培養(yǎng)液的制備方法為：以茶輪斑病菌浸染的病變?nèi)~片為原料，制備得到孢子液，將所述孢子液接種于pda培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到純化病原菌；將所述純化病原菌接種于pd培養(yǎng)基，于25～28℃，180rpm搖瓶培養(yǎng)1～2d即得。
13、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述菌絲體的制備方法為：將所述茶輪斑病菌培養(yǎng)液培養(yǎng)液于pd培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h得到幼嫩菌絲體，過濾，得到菌絲體。
14、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述菌絲體的濃度為(1～10)×108個/ml，所述溶壁酶液的濃度為10mg/ml。
15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果在于：
16、本專利技術(shù)提供了一種茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，本專利技術(shù)利用peg-ca2+介導(dǎo)的方法對茶輪斑病原菌進(jìn)行綠色熒光蛋白(gfp)遺傳轉(zhuǎn)化，在國內(nèi)首次建立了茶輪斑病原菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系，并獲得了穩(wěn)定遺傳的綠色熒光蛋白gfp轉(zhuǎn)化菌。茶輪斑病原菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的建立為探索茶輪斑致病的相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)；為后續(xù)追蹤茶輪斑病原的侵染和定殖提供了材料；為茶輪斑病菌與茶樹的分子互作機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)；為茶輪斑病的防止提供了新的研究路徑；為類似真菌的轉(zhuǎn)化機(jī)制提供了新的參考。
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1.一種茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述含有聚乙二醇和鈣離子的緩沖液為由400g/LPEG3350、1.2M山梨醇、50mM?pH為8.0的Tris-HCl和50mMCaCl2混合，抽濾除菌所得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，以原生質(zhì)體的濃度5×(107～108)個/mL計，所述含有聚乙二醇和鈣離子的緩沖液分2次加入，每次加入2mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述原生質(zhì)體與質(zhì)粒的體積配比為8～10:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述原生質(zhì)體與PD培養(yǎng)基的體積比為1:20～30。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，加入含抗生素的PDA培養(yǎng)基具體為：加入含抗生素Ⅰ的PDA培養(yǎng)基，混勻，凝固，再加入含抗生素Ⅱ的PDA培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述茶輪斑病菌培養(yǎng)液的制備方法為：以茶輪斑病菌浸染的病變?nèi)~片為原料，制備得到孢子液，將所述孢子液接種于PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到純化病原菌；將所述純化病原菌接種于PD培養(yǎng)基，于25～28℃，180rpm搖瓶培養(yǎng)1～2d即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述菌絲體的制備方法為：將所述茶輪斑病菌培養(yǎng)液培養(yǎng)液于PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h得到幼嫩菌絲體，過濾，得到菌絲體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述菌絲體的濃度為(1～10)×108個/mL，所述溶壁酶液的濃度為10mg/mL。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述含有聚乙二醇和鈣離子的緩沖液為由400g/lpeg3350、1.2m山梨醇、50mm?ph為8.0的tris-hcl和50mmcacl2混合，抽濾除菌所得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，以原生質(zhì)體的濃度5×(107～108)個/ml計，所述含有聚乙二醇和鈣離子的緩沖液分2次加入，每次加入2ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述原生質(zhì)體與質(zhì)粒的體積配比為8～10:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，所述原生質(zhì)體與pd培養(yǎng)基的體積比為1:20～30。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶輪斑病菌原生質(zhì)體的再生方法，其特征在于，加入含抗生素的pda培養(yǎng)基具體為：加入含抗生素ⅰ的pda培養(yǎng)基，混勻，凝固，再加入含抗生素ⅱ的pda培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的茶輪斑病...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：武廣珩，傅仙玉，平鈞雄，劉午鴻，齊賽洋，羅心陽，郭依娜，戴方妍，呂橄，趙升云，
申請(專利權(quán))人：武夷學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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