本發明專利技術公開了一種利用含木糖的底物發酵生產含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，采用低能離子束誘變的方法，誘變篩選出可以高效利用木糖的高山被孢霉，以葡萄糖和木糖的混合糖作為碳源發酵生產富含花生四烯酸的微生物油脂。本發明專利技術利用廉價的木質纖維素水解糖為發酵底物，經產油微生物轉化獲取油脂，將顯著降低微生物油脂生產成本，形成節約耕地、可連續生產的油脂獲取路線，并且還有利于環境保護和社會經濟可持續發展。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種生產微生物油脂的方法，具體是一種生產含有花生四烯酸的微生 物油脂的方法。
花生四烯酸(Arachidonic Acid)簡稱ARA，是5，8，11，14-二十碳四烯酸。它是人體的一種必需脂肪酸，其分子結構式為<formula>formula see original document page 3</formula>從分子結構式中可見，該脂肪酸含有20個碳原子，4個雙鍵，其中第一個雙鍵起始 于甲基端起第6個碳原子上，故屬于n-6系列的多不飽和脂肪酸，簡記為20:4(n-6)。ARA是人體中含量最豐富也是最活躍的C20PUFA。它主要存在于器官、肌肉和血 液組織中，在血液、肝臟、肌肉和其它器官系統中作為主要與磷脂結合的結構脂類起著重 要作用。除了主要的結構脂類作用之外，ARA還是許多循環二十烯酸衍生的生物活性物質 (eicosenoid)，例如前列腺素E :(PGE2)，前列腺環素(PG12)，血栓烷A (TxA )，和白細胞 三烯IeukotireneB+(LTB4)和C，(LTC4)的直接前體。這些eicosenoid具有對脂蛋白代 謝，血液流變學，血管彈性，白細胞功能和血小板激活的調節作用。盡管ARA對人體很重要，但是它不能在體內從頭合成。ARA是通過必需脂肪酸亞油 酸(LOA)的延長和去飽和來合成的。該過程需要酶△ 6-去飽和酶的存在，該酶在人體內含 量很低。所以，大多數ARA必須靠飲食提供，這一點在身體的快速成長期，例如嬰兒期，尤為 重要。嬰兒在第一年中其體重可增至2至3倍。所以，需要大量的飲食ARA。世界糧農組織 和衛生組織(FA0/WH0)在“人類營養油脂”(1995)的報告中建議孕婦與嬰幼兒食譜每天應 有60mg/kg (體重)ARA的攝入量。花生四烯酸主要來源有植物、動物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但花生四烯 酸在動物組織中含量低，一般小于0. 2% (wt/wt)，來源也有限，而微生物發酵法則為生產 花生四烯酸開辟了新途徑，它具有不受原材料及氣候限制、生長周期短、培養工藝簡單、花 生四烯酸含量高等特點，近幾年已成為國內外研究的熱點。而利用各種廉價原材料培養產 油微生物，可進一步降低微生物油脂的生產成本。微生物發酵底物范圍較廣，包括可直接利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜等，以及需 要經過預處理的淀粉、纖維素等。目前國內外發酵法生產花生四烯酸的主要原料是葡萄糖 等糧食作物。利用廉價碳源，如木質纖維素水解產物，直接發酵生產微生物油脂的方法尚未 見公開報道。每年有大量的農林業廢棄物(如玉米秸稈)等木質纖維素材料用焚燒等方式 不當處理，既造成浪費又污染環境。通過技術進步，以秸稈等木質纖維素材料為原料生產花 生四烯酸的成本有望低于糧食發酵生產花生四烯酸的成本。木質纖維素是地球上最豐富的有機資源之一，它占地球生物質總量的60-80%。， 主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，在農業廢棄物中的三者的含量大約是30-40%纖維素，20-30%半纖維素，10-25%木質素。其中，葡萄糖是纖維素的組成單元，木糖是半纖維 素的主要組成單元。在植物纖維材料水解液中木糖占30%左右，是繼葡萄糖之后自然界中 最豐富的糖分，因此，葡萄糖木糖的共利用是開發木質纖維素的關鍵技術之一。
技術實現思路
本專利技術提供了一種利用含木糖的底物發酵生產含有花生四烯酸的微生物油脂的 方法，利用廉價的木質纖維素水解糖為發酵底物，經產油微生物轉化獲取油脂，將顯著降低 微生物油脂生產成本，形成節約耕地、可連續生產的油脂獲取路線，并且還有利于環境保護 和社會經濟可持續發展。本專利技術的技術方案為利用含木糖的底物發酵生產含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于 包括以下步驟(1)、原始菌種的活化將高山被孢霉菌種接種到斜面培養基上在25-30°C下培養 7-10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板，洗脫下平板孢子，過濾得孢子懸液；(2)、離子束誘變將孢子懸液涂布于無菌平皿上，風干，進行脈沖式N+離子注入， 選用N+離子的能量和劑量分別是IOKev和1. 3 X IO15NVcm2 ；然后將離子注入過的孢子懸液 用無菌水洗脫后，稀釋涂布于木糖篩選平板培養基上在25-30°C下培養，挑選出能在木糖篩 選平板培養基上生長且菌絲生長旺盛的的菌落，作為初篩的單菌落，將初篩的單菌落轉接 斜面培養，接入搖瓶發酵培養轉接搖瓶發酵培養基中發酵，挑選出生物量和油脂含量高的 菌種作為復篩的結果，然后對復篩的結果重復進行離子束誘變、初篩和復篩過程；所述的木 糖篩選平板培養基中主要組分的重量百分含量為木糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏1.0%， 基質蒸餾水，pH8.0，28°C ；(3)、液體培養將離子束誘變、篩選過的菌種于PH值為7. 5-8. 5液體培養基中在 28-30°C下培養18-24小時，液體培養基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖4_6%、木 糖2-5%、蛋白胨0. 5-1%、豆粕0. 5-1. 5%，基質蒸餾水；(4)、擴大培養將液體培養后的菌種接種于發酵罐中的發酵培養基中在28-30°C 下培養10-12天，發酵培養基中原料組分的重量百分比為葡萄糖4-6%、木糖2-5%、蛋白 胨0. 5-1%、豆粕0. 5-1.5%，基質為蒸餾水；(5)、菌絲體的油脂提取將擴大培養后得到的菌絲體進行收集，然后進行離心、洗 滌、100-110°C干燥、萃取得成品。所述的生產含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的斜面培養 基中主要原料成分的重量百分份比為葡萄糖1.5-2.5%，馬鈴薯浸出液18-22%，瓊脂 1. 5-2%。所述的生產含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的液體培養 的搖床轉度為180-230rpm，PH值為8，液體培養基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖 5%、木糖3%、蛋白胨0.7%、豆粕1%;所述的擴大培養是將液體培養后的菌種以8-12%的 比例接種于發酵罐中，發酵罐的通氣量為1. 0-1. 5L/min，攪拌速度為400-500轉/分，發酵 罐內PH值為7. 5-8. 5，溫度為28°C，時間為10-12天，發酵培養基中主要原料組分的重量百 分比為葡萄糖5%、木糖3%、蛋白胨0. 7%、豆粕1%，基質為蒸餾水，發酵培養基的PH值為 7. 5-8. 5，溫度為 28°C ；所述的生產含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于所述的木糖選用 含有五碳糖的木質纖維素水解糖；所述的油脂的萃取選用石油醚、正己烷。本專利技術各種培養基的基質一般均為蒸餾水。本專利技術采用離子束修飾細胞技術誘變篩選微生物菌種，獲得能高效利用木糖的高山被孢霉優良菌株，按照常規方法將該菌株接種到含木糖的發酵培養基中，通氣培養至發 酵液中總還原糖濃度降至1 %以下時停止，離心收集菌體，經常規的有機溶劑提取方法獲得 微生物油脂，并采用氣相色譜法檢測油脂中多不飽和脂肪酸的含量。在本專利技術中，在適合于生產含ARA油脂的條件下培養真菌。一般，真菌培養技術是 本領域技術人員所熟知的，這些技術可以用于本專利技術方法。例如，可以在搖瓶中進行真菌接 種量的深層培養。搖瓶中裝有生長培養基，植入真菌菌絲，在往復式搖床上培養約5至10 天。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
利用含木糖的底物發酵生產含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于：包括以下步驟： （１）、原始菌種的活化：將高山被孢霉菌種接種到斜面培養基上在２５－３０℃下培養７－１０天，選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板，洗脫下平板孢子，過濾得孢子懸液； （２）、離子束誘變：將孢子懸液涂布于無菌平皿上，風干，進行脈沖式Ｎ＋離子注入，選用Ｎ＋離子的能量和劑量分別是１０Ｋｅｖ和１．３×１０↑［１５］Ｎ＋／ｃｍ↑［２］；然后將離子注入過的孢子懸液用無菌水洗脫后，稀釋涂布于木糖篩選平板培養基上在２５－３０℃下培養，挑選出能在木糖篩選平板培養基上生長且菌絲生長旺盛的的菌落，作為初篩的單菌落，將初篩的單菌落轉接斜面培養，接入搖瓶發酵培養轉接搖瓶發酵培養基中發酵，挑選出生物量和油脂含量高的菌種作為復篩的結果，然后對復篩的結果重復進行離子束誘變、初篩和復篩過程；所述的木糖篩選平板培養基中主要組分的重量百分含量為：木糖２％，蛋白胨０．５％，酵母膏１．０％，基質蒸餾水，ｐＨ８．０，２８℃； （３）、液體培養：將離子束誘變、篩選過的菌種于ＰＨ值為７．５－８．５液體培養基中在２８－３０℃下培養１８－２４小時，液體培養基中主要原料組分的重量百分比為：葡萄糖４－６％、木糖２－５％、蛋白胨０．５－１％、豆粕０．５－１．５％，基質蒸餾水； （４）、擴大培養：將液體培養后的菌種接種于發酵罐中的發酵培養基中在２８－３０℃下培養１０－１２天，發酵培養基中原料組分的重量百分比為：葡萄糖４－６％、木糖２－５％、蛋白胨０．５－１％、豆粕０．５－１．５％，基質為蒸餾水； （５）、菌絲體的油脂提取：將擴大培養后得到的菌絲體進行收集，然后進行離心、洗滌、１００－１１０℃干燥、萃取得成品。...
【技術特征摘要】
利用含木糖的底物發酵生產含有花生四烯酸的微生物油脂的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、原始菌種的活化將高山被孢霉菌種接種到斜面培養基上在25-30℃下培養7-10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的新鮮平板，洗脫下平板孢子，過濾得孢子懸液；(2)、離子束誘變將孢子懸液涂布于無菌平皿上，風干，進行脈沖式N+離子注入，選用N+離子的能量和劑量分別是10Kev和1.3×1015N+/cm2；然后將離子注入過的孢子懸液用無菌水洗脫后，稀釋涂布于木糖篩選平板培養基上在25-30℃下培養，挑選出能在木糖篩選平板培養基上生長且菌絲生長旺盛的的菌落，作為初篩的單菌落，將初篩的單菌落轉接斜面培養，接入搖瓶發酵培養轉接搖瓶發酵培養基中發酵，挑選出生物量和油脂含量高的菌種作為復篩的結果，然后對復篩的結果重復進行離子束誘變、初篩和復篩過程；所述的木糖篩選平板培養基中主要組分的重量百分含量為木糖2％，蛋白胨0.5％，酵母膏1.0％，基質蒸餾水，pH8.0，28℃；(3)、液體培養將離子束誘變、篩選過的菌種于PH值為7.5-8.5液體培養基中在28-30℃下培養18-24小時，液體培養基中主要原料組分的重量百分比為葡萄糖4-6％、木糖2-5％、蛋白胨0.5-1％、豆粕0.5-1.5％，基質蒸餾水；(4)、擴大培養將液體培養后的菌種接種于發酵罐中的發酵培養基中在28-30℃下培養10-12天，發酵...
【專利技術屬性】
技術研發人員：袁成凌，鄭之明，張臘梅，貢國鴻，
申請(專利權)人：中國科學院等離子體物理研究所，
類型：發明
國別省市：34[中國|安徽]
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