【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及一種來源于弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)的酪氨酸酚裂解酶(tyrosine?phenol-lyase,tpl)突變體和編碼基因及其在催化合成左旋多巴(l-dopa)中的應用。
技術介紹
1、帕金森綜合征是一種常見的中老年慢性神經系統(tǒng)退行性疾病，以黑質致密部多巴胺能神經元丟失、紋狀體多巴胺減少為特征，臨床特征有休息性震顫、肌強直、動作遲緩和姿勢平衡障礙等運動癥狀，以及嗅覺減退、便秘、睡眠行為異常和抑郁等非運動癥狀。隨著病程進展，患者臨床癥狀逐漸加重，疾病中后期會出現(xiàn)平衡障礙、吞咽困難和語言障礙等癥狀，使患者生活無法自理，生活質量嚴重下降。
2、帕金森病的治療手段首選是藥物治療，通過提高中樞神經系統(tǒng)多巴胺的濃度是其中的一種重要思路，但多巴胺無法穿過血腦屏障，這就需要左旋多巴來發(fā)揮作用。左旋多巴是多巴胺的前體物質，本身無藥理活性，可通過血腦屏障進入中樞，經多巴脫羧酶作用轉化成多巴胺而發(fā)揮藥理作用，因此在抗帕金森病的藥物中是一種重要的成分。
3、左旋多巴可以從天然植物中提取，如蠶豆和毛豆，但往往需要多步提取，原材料來源也受到天氣和季節(jié)等的影響，難以實現(xiàn)大量生產，和市場需求差距較大。化學合成法市面上多以不對稱合成為主，步驟繁瑣，且對環(huán)境不友好，在工業(yè)生產上應用也受到限制。生物催化反應條件溫和，從起始底物到左旋多巴一步即可完成轉化，生產工藝簡單可控，可操作性強，很少有副產物生成，產物的純度和對映選擇性強。
4、目前生物催化法主要包括酶催化法和代謝調控法，后
5、tpl的天然底物為苯酚，丙酮酸鈉和銨鹽，當苯酚替換成鄰苯二酚時，可專一性合成左旋多巴，而對于非天然的底物，活性會有所下降。
6、酪氨酸酚裂解酶合成左旋多巴的方法研究重點在于對高產左旋多巴菌株的發(fā)現(xiàn)和基因工程的改造。近幾年用tpl催化左旋多巴合成的專利中，江南大學申請的專利通過理性設計獲得了弗氏檸檬酸菌(citrobacter?freundii)來源的tpl突變體e313m，其活性相比對照菌株提高了142.9％，于2019年申請專利保護突變體的序列(公開號：cn?109897845b)；浙江工業(yè)大學申請的專利通過隨機突變獲得了具核梭桿菌(f.nucleatum)來源的tpl突變體，與野生型相比左旋多巴產量提高了17％-25％，于2016年申請專利保護突變體的序列(公開號：cn106754846b)；浙江工業(yè)大學申請的專利通過隨機突變獲得了克呂沃爾氏菌(kluyvera?intermedia)來源的tpl突變體，與野生型相比左旋多巴產量提高了30％，于2019年申請專利保護突變體的序列(公開號：cn?110331153?b)；另外還有南通大學申請的專利發(fā)現(xiàn)的脫硫細菌(desulfitobacterium?hafniense)來源的tpl于2019年申請了專利(公開號：cn?110791536a)。
7、這些專利中獲得的tpl催化活性較野生型有所提高，但催化反應進行尚不完全，且tpl的熱穩(wěn)定性都不高，反應工藝需要控制在15-20℃甚至更低，增加了左旋多巴的生產成本。因此，開發(fā)高活性和具有耐熱性和的tpl對實現(xiàn)左旋多巴的工業(yè)化生產具有十分重要的意義。
技術實現(xiàn)思路
1、來源于弗氏檸檬酸桿菌的酪氨酸酚裂解酶的天然底物為苯酚，對非天然底物鄰苯二酚轉化效率低，野生型的轉化率只有59％，且熱穩(wěn)定性較差。本專利技術應用定向進化手段對來源于弗氏檸檬酸桿菌的酪氨酸酚裂解酶進行改造，通過分子對接結果結合熱穩(wěn)定性設計改造，設計了29個位點的飽和突變體庫，通過高通量篩選和迭代突變，獲得了44個單點突變體，其中31個經過液相檢測驗證活性高于野生型，經過迭代突變后獲得了一系列雙突變體，其中轉化率大于90％的雙突變體有16個，活性最高的突變體較野生型增長了40％。本專利技術獲得的對鄰苯二酚活性提高的一系列突變體，可應用于左旋多巴的生物催化合成中。
2、本專利技術的第一個目的是保護cftpl的一系列突變體。
3、所述cftpl的野生型基因如seq?id?no.1所示，氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
4、所述cftpl突變體是將seq?id?no.2的第43位、第110位、第141位、第276位、第186位、第207位、第230位和454位的氨基酸殘基中至少一個氨基酸殘基進行突變后得到的突變體。
5、進一步地，所述cftpl的突變體包括如下至少一種突變：將cftpl的氨基酸序列的第43位由異亮氨酸突變?yōu)榛虮彼峄蚋拾彼峄蚶i氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第110位由丙氨酸突變?yōu)榈鞍彼峄蚪z氨酸或半胱氨酸或組氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第141位由纈氨酸突變?yōu)榱涟彼峄虮彼峄虍惲涟彼帷ftpl的氨基酸序列的第276位由絲氨酸突變?yōu)楣劝彼峄蛱於彼峄蛱K氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第186位由亮氨酸突變?yōu)榈鞍彼峄蚋拾彼峄蚪z氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第207位由組氨酸突變?yōu)槔野彼峄蛱K氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第230位由谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼帷ftpl的氨基酸序列的第454位由天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?/p>
6、編碼上述cftpl的突變體的核酸序列也屬于本專利技術的保護范圍。
7、本專利技術的第二個目的是保護cftpl突變體的基因工程菌。
8、在本專利技術的一種實施方式中，以大腸桿菌為宿主，以pet系列載體為表達載體。
9、本專利技術的第三個目的是提供一種左旋多巴的全細胞轉化制備方法，是以上述基因工程菌為全細胞催化劑，以丙酮酸鈉、鄰苯二酚、乙酸銨為底物，進行全細胞轉化。所述方法具體包括以下步驟：
10、種子液先在37℃下培養(yǎng)6-8h，再加入誘導劑0.2mm的iptg并降溫至20-25℃，繼續(xù)發(fā)酵12-20h。培養(yǎng)液高速離心收集濕菌體，濕菌體用反應液重懸，反應液中濕菌體的終濃度為20-60g/l，重懸液含有丙酮酸鈉18g/l，鄰苯二酚11g/l，乙酸銨30g/l，na2so3?4g/l，edta2g/l，5-磷酸吡哆醛30μm，氨水調節(jié)ph為8.0；反應條件為25-45℃，180-500rpm，反應需避光，反應4h后，向反應液中按20％體積量加入0.1m鹽酸，經重懸后12000rpm離心本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種酪氨酸酚裂解酶突變體，其特征在于，所述突變體是將SEQ?ID?NO.2的第43位、第110位、第141位、第276位、第186位、第207位、第230位和454位的氨基酸殘基中至少一個氨基酸殘基進行突變后得到。
2.如權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體存在如下至少一種突變：將CfTPL的氨基酸序列的第43位由異亮氨酸突變?yōu)榛虮彼峄蚋拾彼峄蚶i氨酸、將CfTPL的氨基酸序列的第110位由丙氨酸突變?yōu)榈鞍彼峄蚪z氨酸或半胱氨酸或組氨酸、將CfTPL的氨基酸序列的第141位由纈氨酸突變?yōu)榱涟彼峄虮彼峄虍惲涟彼帷fTPL的氨基酸序列的第276位由絲氨酸突變?yōu)楣劝彼峄蛱於彼峄蛱K氨酸、將CfTPL的氨基酸序列的第186位由亮氨酸突變?yōu)榈鞍彼峄蚋拾彼峄蚪z氨酸、將CfTPL的氨基酸序列的第207位由組氨酸突變?yōu)槔野彼峄蛱K氨酸、將CfTPL的氨基酸序列的第230位由谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼帷fTPL的氨基酸序列的第454位由天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?/p>
3.如權利要求1或2所述的突變體的編碼核酸。
4.含有如權利要求3所述的編碼核酸表達載體，
5.含有如權利要求4所述的表達載體的基因工程菌，所述的基因工程菌，其特征在于，其出發(fā)菌為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌或畢赤酵母。
6.如權利要求1或2所述的突變體在制備左旋多巴中的應用。
7.一種左旋多巴的生物合成方法，其特征在于，以權利要求5所述的基因工程菌全細胞或粗酶液或純酶作為催化劑，以丙酮酸鈉、鄰苯二酚、乙酸銨為底物，催化底物轉化生成左旋多巴。
8.權利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，具體包括以下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)所述基因工程菌，得到的培養(yǎng)液高速離心收集濕菌體，濕菌體用反應液重懸以用于全細胞轉化。
9.如權利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，反應液含有18?g/L丙酮酸鈉，11?g/L鄰苯二酚，30g/L乙酸銨，4g/L?Na2SO3，2g/L?EDTA，30μM5-磷酸吡哆醛，氨水調節(jié)pH為8.0-8.5；反應條件為25-45℃，180-500rpm，反應避光進行0.5-4?h。
...【技術特征摘要】
1.一種酪氨酸酚裂解酶突變體，其特征在于，所述突變體是將seq?id?no.2的第43位、第110位、第141位、第276位、第186位、第207位、第230位和454位的氨基酸殘基中至少一個氨基酸殘基進行突變后得到。
2.如權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體存在如下至少一種突變：將cftpl的氨基酸序列的第43位由異亮氨酸突變?yōu)榛虮彼峄蚋拾彼峄蚶i氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第110位由丙氨酸突變?yōu)榈鞍彼峄蚪z氨酸或半胱氨酸或組氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第141位由纈氨酸突變?yōu)榱涟彼峄虮彼峄虍惲涟彼帷ftpl的氨基酸序列的第276位由絲氨酸突變?yōu)楣劝彼峄蛱於彼峄蛱K氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第186位由亮氨酸突變?yōu)榈鞍彼峄蚋拾彼峄蚪z氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第207位由組氨酸突變?yōu)槔野彼峄蛱K氨酸、將cftpl的氨基酸序列的第230位由谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼帷ftpl的氨基酸序列的第454位由天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?/p>
3.如權利要求1或2所述的突變體的編碼核酸。
<...【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：畢悅欣，張嚴勻，張曉立，李華珍，章家泉，
申請(專利權)人：百葵銳深圳生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。