本發明專利技術公開了一種用多重PCR法鑒別的細胞種屬的試劑盒。具體地，公開了一種引物對組合，所述引物對為引物對2、引物對4、引物對6、引物對8、引物對9和引物對10中的任何一種或多種。使用本發明專利技術提供的引物對組合的擴增結果特異性高，操作簡單無需純化，檢測靈敏度高：細胞用量可少至5×105，交叉污染檢測限可達到1％及以下，檢測效率高：可采用單孔10重反應體系，真實客觀且結果確定。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子遺傳學領域，具體涉及一種用多重pcr法鑒別的細胞種屬的試劑盒。
技術介紹
1、體外培養的動物細胞是生物制品生產的重要起始材料，然而由于有些細胞有著相同的營養成分和培養環境需求，導致其在培養和傳代過程中容易發生細胞間的交叉污染。這種污染不同于容易辨識的微生物污染，如細菌、真菌或酵母等引起的污染直接可通過培養基顏色變化、顯微鏡下觀察以及細胞的生長狀態等便可判斷。細胞交叉污染長期以來未引起人們的重視，導致細胞生物學歷史上發生了多起重大的細胞交叉污染而導致細胞誤用的事件。目前，細胞種屬鑒別和交叉污染檢測受到諸多機構的重視，特別是對于生物制品用工程細胞來講尤其重要。
2、fda、fda、ich、who要求對用于制藥領域的實驗中所使用細胞系應進行“身份鑒定”和純度測試，包括細胞庫(mcb、wcb)和生產終末細胞(eopc)。2020版藥典中，也規定新建細胞系/株、細胞庫(mcb、wcb)和生產終末細胞(eopc)均應進行鑒別試驗，以確認為本細胞，且無其他細胞的交叉污染。
3、目前str圖譜分析法是目前細胞鑒別及交叉污染檢測的常用方法，但該方法僅適用于人源及鼠源細胞種屬鑒別的檢測，所以應用范圍受到很大限制。染色體核型分析和同工酶技術也常被用于細胞鑒別及交叉污染檢測，但此類檢測方法具有細胞用量大、操作復雜、耗時長及成本高且檢測靈敏度低的缺點。因此開發一種靈敏、快速、穩定且操作簡便、特異性強的方法，用于生物制品生產涉及到的多細胞鑒別和種屬間交叉污染檢測。
技術實現思路</p>1、為了解決現有技術中缺乏快速穩定鑒別多細胞和種屬的產品/方法的缺陷，本專利技術提供了一種用多重pcr法鑒別的細胞種屬的試劑盒。
2、為了解決現有技術的問題，本專利技術第一方面提供一種引物對組合，所述引物對為引物對1、引物對2、引物對4、引物對6、引物對8、引物對9和引物對10中的任何一種或多種；其中，
3、所述引物對1由核苷酸序列如seq?id?no:1所示的正向引物1f和核苷酸序列如seqid?no:2所示的反向引物1r組成；
4、所述引物對2由核苷酸序列如seq?id?no:3所示的正向引物2f和核苷酸序列如seqid?no:4所示的反向引物2r組成；
5、所述引物對4由核苷酸序列如seq?id?no:7所示的正向引物4f和核苷酸序列如seqid?no:8所示的反向引物4r組成；
6、所述引物對6由核苷酸序列如seq?id?no:11所示的正向引物6f和核苷酸序列如seq?id?no:12所示的反向引物6r組成；
7、所述引物對8由核苷酸序列如seq?id?no:15所示的正向引物8f和核苷酸序列如seq?id?no:16所示的反向引物8r組成；
8、所述引物對9由核苷酸序列如seq?id?no:17所示的正向引物9f和核苷酸序列如seq?id?no:18所示的反向引物9r組成；
9、所述引物對10由核苷酸序列如seq?id?no:19所示的正向引物10f和核苷酸序列如seq?id?no:20所示的反向引物10r組成。
10、在某些實施方案中，其還包括引物對3、引物對5和引物對7中的任何一種或多種；其中
11、所述引物對3由核苷酸序列如seq?id?no:5所示的正向引物3f和核苷酸序列如seqid?no:6所示的反向引物3r組成；
12、所述引物對5由核苷酸序列如seq?id?no:9所示的正向引物5f和核苷酸序列如seqid?no:10所示的反向引物5r組成；
13、所述引物對7由核苷酸序列如seq?id?no:13所示的正向引物7f和核苷酸序列如seq?id?no:14所示的反向引物7r組成。
14、在某些實施方案中，其包括引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10；其中，
15、所述引物對1由核苷酸序列如seq?id?no:1所示的正向引物1f和核苷酸序列如seqid?no:2所示的反向引物1r組成；
16、所述引物對2由核苷酸序列如seq?id?no:3所示的正向引物2f和核苷酸序列如seqid?no:4所示的反向引物2r組成；
17、所述引物對3由核苷酸序列如seq?id?no:5所示的正向引物3f和核苷酸序列如seqid?no:6所示的反向引物3r組成；
18、所述引物對4由核苷酸序列如seq?id?no:7所示的正向引物4f和核苷酸序列如seqid?no:8所示的反向引物4r組成；
19、所述引物對5由核苷酸序列如seq?id?no:9所示的正向引物5f和核苷酸序列如seqid?no:10所示的反向引物5r組成；
20、所述引物對6由核苷酸序列如seq?id?no:11所示的正向引物6f和核苷酸序列如seq?id?no:12所示的反向引物6r組成；
21、所述引物對7由核苷酸序列如seq?id?no:13所示的正向引物7f和核苷酸序列如seq?id?no:14所示的反向引物7r組成；
22、所述引物對8由核苷酸序列如seq?id?no:15所示的正向引物8f和核苷酸序列如seq?id?no:16所示的反向引物8r組成；
23、所述引物對9由核苷酸序列如seq?id?no:17所示的正向引物9f和核苷酸序列如seq?id?no:18所示的反向引物9r組成；
24、所述引物對10由核苷酸序列如seq?id?no:19所示的正向引物10f和核苷酸序列如seq?id?no:20所示的反向引物10r組成。
25、本專利技術第二方面提供一種試劑盒，所述試劑盒中包括如本專利技術第一方面所述的引物對組合。
26、在某些實施方案中，所述試劑盒還包括緩沖液、dntp和/或多聚酶。
27、上述緩沖液可為本領域中常規可用來進行細胞種屬鑒定的緩沖液；上述試劑盒中還可包括本領域中常規可用來進行細胞種屬鑒定的試劑。
28、本專利技術第三方面提供一種用于多重pcr的檢測方法，包括以下步驟：
29、(1)以待測細胞的基因組dna為模板，利用如本專利技術第一方面所述的引物對組合進行pcr擴增；
30、(2)pcr反應結束后，對pcr擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據擴增產物的dna片段大小判斷樣品來源的細胞種屬。
31、在某些實施方案中，所述檢測方法在步驟(1)前還包括樣品準備和dna模板提取的步驟。
32、在某些實施方案中，(1)中，
33、所述pcr擴增的反應體系為：引物對組合的混合樣的終濃度為50～800nm，優選為70～600nm；和/或，dna模板的終濃度為0.1～10ng/μl，優選為0.5～6ng/μl。
34、較佳地，(1)中，
35、所述pcr擴增的反應程序為：95～98℃預變性1～5本文檔來自技高網
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【技術保護點】
1.一種引物對組合，其特征在于，所述引物對為引物對1、引物對2、引物對4、引物對6、引物對8、引物對9和引物對10中的任何一種或多種；其中，
2.如權利要求1所述的引物對組合，其特征在于，其還包括引物對3、引物對5和引物對7中的任何一種或多種；其中
3.如權利要求1或2所述的引物對組合，其特征在于，其包括引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10；其中，
4.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括如權利要求1～3任一項所述的引物對組合。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括緩沖液、dNTP和/或多聚酶。
6.一種用于多重PCR的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法在步驟(1)前還包括樣品準備和DNA模板提取的步驟。
8.如權利要求6或7所述的檢測方法，其特征在于，(1)中，
9.如權利要求6～8中任一項所述的檢測方法，其特征在于，(2)中，所述判斷的標準為：
10.如權利要求1～3任一項所述的引物對組合在多細胞種屬鑒別和交叉污染檢測或制備用于多細胞種屬鑒別和交叉污染檢測的試劑盒中的應用。
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【技術特征摘要】
1.一種引物對組合，其特征在于，所述引物對為引物對1、引物對2、引物對4、引物對6、引物對8、引物對9和引物對10中的任何一種或多種；其中，
2.如權利要求1所述的引物對組合，其特征在于，其還包括引物對3、引物對5和引物對7中的任何一種或多種；其中
3.如權利要求1或2所述的引物對組合，其特征在于，其包括引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8、引物對9和引物對10；其中，
4.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括如權利要求1～3任一項所述的引物對組合。
5.如權利要求4所述的試...
【專利技術屬性】
技術研發人員：納濤，吳雪伶，孟淑芳，張琪夢，楊志行，袁翔鶴，范珊珊，盧雙紅，
申請(專利權)人：中國食品藥品檢定研究院，
類型：發明
國別省市：
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