本發明專利技術屬于禾谷鐮孢菌檢測領域，具體涉及一種特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組及其應用。本發明專利技術提供了特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組SEQ?ID?NO.1?SEQ?ID?NO.5，同時，本發明專利技術提供一種高靈敏TaqMan實時熒光定量PCR檢測禾谷鐮孢菌的方法，包括以下步驟：在禾谷鐮孢菌基因組找出特異性片段，根據特異性片段設計特異性引物和至少一條探針，構建高靈敏TaqMan實時熒光定量PCR體系檢測土壤中禾谷鐮孢菌含量。本發明專利技術針對禾谷鐮孢菌基因組中的特異性片段，設計特異性引物探針，設計所得的引物探針組對種屬相近的絲狀真菌具有良好的特異性。并具有良好的檢測靈敏度。
1、小麥赤霉病由禾谷鐮孢菌(fusarium?graminearum)引起，從苗期到穗期均可發生，表現為苗腐、莖基腐、稈腐和穗腐，并以穗腐危害最大。該病侵染小麥后不僅造成嚴重的產量損失，而且麥粒中還產生大量的毒素，食用殘留毒素后可對人體造成危害，該病是小麥生產中最嚴重的病害之一。
2、禾谷鐮孢菌以不同形態在土壤中作物殘體上越冬。條件適宜時，禾谷鐮孢菌釋放子囊孢子，并借氣流、風雨傳播，從而侵染小穗。幾天后產生大量粉紅色霉層，經風雨傳播引起再侵染。因此，土壤中禾谷鐮孢菌的病原菌含量檢測對病害預測至關重要。
3、目前禾谷鐮孢菌的檢測方法很多，如平板檢測法、生物測定法、常規pcr檢測和定量pcr(qpcr)檢測技術等。其中，qpcr技術因其檢測快速，靈敏度高、特異性強、可絕對定量等特點成為病菌檢測最重要的檢測技術。國內外研究者也報道多種qpcr方法來檢測接種物在土壤或殘體中禾谷鐮孢菌的含量。然而，檢測靈敏度對土壤禾谷鐮孢菌的準確檢測十分重要。影響taqman熒光定量pcr檢測靈敏度的因素較多，包括酶的種類、引物序列、探針序列、組分比例、pcr擴增參數等。如何提高痕量核酸檢測方法的靈敏性，一直是科研人員的努力方向。
>3、本專利技術的再一目的在于提供檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒。4、本專利技術的再一目的在于提供禾谷鐮孢菌的檢測方法。
5、根據本專利技術具體實施方式的特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，包括如下引物：
6、seq?id?no.1:atagacctgtccccgcct；
7、seq?id?no.2:cgctgcataaaggtagaggtcat；
8、還包括以下探針中的至少一條：
9、seq?id?no.3：accaaccgccgaccgcattc；
10、seq?id?no.4：agcccgaatacgaac；
11、seq?id?no.5：tgcaactgcatgataac。
12、根據本專利技術具體實施方式的特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。
13、優選的，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團，其中，熒光基團可選fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas等，本專利技術的優選方案為fam；淬滅基團可選tamra、bhq(bhq1、bhq2、bhq3)、mgb等，本專利技術的優選方案為mgb。
14、根據本專利技術具體實施方式的特異性檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒，包括如下引物：
15、seq?id?no.1:atagacctgtccccgcct；
16、seq?id?no.2:cgctgcataaaggtagaggtcat；
17、還包括以下探針中的至少一條：
18、seq?id?no.3：accaaccgccgaccgcattc；
19、seq?id?no.4：agcccgaatacgaac；
20、seq?id?no.5：tgcaactgcatgataac。
21、優選的，所述試劑盒，包括如下引物：
22、seq?id?no.1:atagacctgtccccgcct；
23、seq?id?no.2:cgctgcataaaggtagaggtcat；
24、還包括以下探針：
25、seq?id?no.3：accaaccgccgaccgcattc；
26、seq?id?no.4：agcccgaatacgaac；
27、seq?id?no.5：tgcaactgcatgataac。
28、優選的，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團，其中，熒光基團可選fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas等，本專利技術的優選方案為fam；淬滅基團可選tamra、bhq(bhq1、bhq2、bhq3)、mgb等，本專利技術的優選方案為tamra。
29、根據本專利技術具體實施方式的禾谷鐮孢菌的檢測方法，其利用上述引物探針組進行pcr的步驟。
30、根據本專利技術具體實施方式的禾谷鐮孢菌的檢測方法，pcr擴增體系包括taqmanfast?qpcr?master?mix?10μl，引物各0.5μl，探針各0.3μl，dna模板1μl，ddh2o補足至20μl。
31、根據本專利技術具體實施方式的禾谷鐮孢菌的檢測方法，pcr擴增程序為預變性94℃3min，變性94℃10s，退火/延伸/數據采集58℃35s，變性與退火40個循環。
32、本專利技術的有益效果：
33、本專利技術針對禾谷鐮孢菌基因組中的特異性片段，設計特異性引物探針，設計所得的引物探針組對種屬相近的絲狀真菌具有良好的特異性。靈敏度方面，利用本專利技術的引物探針組進行檢測，所得ct值為28.402-27.071，具有良好的檢測靈敏度。
34、本專利技術構建高靈敏taqman實時熒光定量pcr體系檢測土壤中禾谷鐮孢菌的含量，獲得標準曲線方程為y＝-3.322x+38.17，其中，各梯度質粒拷貝數的對數值為橫坐標，循環閾值ct值為縱坐標建立標準曲線。通過本專利技術的方法檢測土壤中禾谷鐮孢菌的含量，檢測濃度可達102copys/g土。
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【技術保護點】
1.特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，其特征在于，包括如下引物：
2.根據權利要求1所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，其特征在于，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。
3.根據權利要求2所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，其特征在于，熒光基團為FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX或Texas中的一種；淬滅基團為TAMRA、BHQ或MGB中的一種。
4.特異性檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒，其特征在于，包括如下引物：
5.根據權利要求4所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒，其特征在于，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。
6.根據權利要求4所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒，其特征在于，熒光基團為FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX或Texas中的一種；淬滅基團為TAMRA、BHQ或MGB中的一種。
7.禾谷鐮孢菌的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括利用權利要求1所述的引物探針組對待測物的DNA進行PCR的步驟。
8.根據權利要求7所述的禾谷鐮孢菌的檢測方法，其特征在于，PCR擴增體系包括TaqMan?Fast?qPCR?Master?Mix?10μL，引物各0.5μL，探針各0.3μL，DNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。
9.根據權利要求7所述的禾谷鐮孢菌的檢測方法，其特征在于，PCR擴增程序為預變性94℃3min，變性94℃10s，退火/延伸/數據采集58℃35S，變性與退火40個循環。
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【技術特征摘要】
1.特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，其特征在于，包括如下引物：
2.根據權利要求1所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，其特征在于，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。
3.根據權利要求2所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物探針組，其特征在于，熒光基團為fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox或texas中的一種；淬滅基團為tamra、bhq或mgb中的一種。
4.特異性檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒，其特征在于，包括如下引物：
5.根據權利要求4所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒，其特征在于，所述探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。
6.根據權利要求4所述的特異性檢測禾谷鐮孢菌的試劑盒，其特征...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳玉星，韓森，王亞嬌，張昊，栗秋生，孔令曉，
申請(專利權)人：河北省農林科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：
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