【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及核酸編輯工具及其應(yīng)用,屬于基因工程和生物誘變。
技術(shù)介紹
1、正常情況下，dna呈雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，堿基位于雙螺旋內(nèi)部(疏水環(huán)境)，這對(duì)于維持遺傳信息的穩(wěn)定性至關(guān)重要。然而，雙鏈dna(dsdna)的解繞是dna復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組所必需的，這也是修飾遺傳信息的機(jī)會(huì)。例如，胞苷脫氨酶(pmcda1、aid和rapobec1)作用于單鏈dna(ssdna)并用于堿基編輯，這需要crispr-cas系統(tǒng)介導(dǎo)的dsdna解繞。然而，crispr系統(tǒng)依賴于原型間隔序列(pam)的存在，以識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)dna序列。pam的存在限制了核酸編輯工具在基因組中潛在的編輯位點(diǎn)。
2、谷氨酸棒桿菌作為一種工業(yè)微生物，特別是在氨基酸工業(yè)中占有重要地位。近年來，代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展極大地促進(jìn)了谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠的創(chuàng)建和優(yōu)化。因此，谷氨酸棒桿菌的產(chǎn)物譜已經(jīng)從傳統(tǒng)的氨基酸(如l-谷氨酸、l-賴氨酸、l-精氨酸)擴(kuò)展到近100種天然和非天然化合物，包括有機(jī)酸、多元醇、酶等?；蚪M進(jìn)化技術(shù)的進(jìn)步在獲得所需表型(特別是適應(yīng)工業(yè)條件)和基因功能研究中發(fā)揮著重要作用。為了進(jìn)一步提升谷氨酸棒桿菌的基因組突變率，文獻(xiàn)(engineering?of?the?dna?replication?and?repairmachinery?to?develop?binary?mutators?for?rapid?genome?evolution?ofcorynebacterium?glutamicum)基于dna修復(fù)機(jī)制的基因組進(jìn)化方法使谷氨酸棒桿菌基因組
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、[技術(shù)問題]
2、本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是：提供一種突變效率高，適用性更廣的核酸編輯工具及其應(yīng)用。
3、[技術(shù)方案]
4、為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：
5、本專利技術(shù)首先提供了一種核酸編輯工具，所述核酸編輯工具包括以下組件：
6、(a)胞苷脫氨酶；
7、(b)rna聚合酶亞基；
8、所述rna聚合酶亞基選自rna聚合酶的α、β、β’亞基中的至少一種；
9、所述胞苷脫氨酶通過第一連接肽與所述rna聚合酶亞基連接組成融合蛋白。
10、在一種實(shí)施方式中，所述rna聚合酶亞基為rna聚合酶的α亞基。
11、在一種實(shí)施方式中，所述rna聚合酶亞基來源于谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)。
12、在一種實(shí)施方式中，所述rna聚合酶α亞基含有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。
13、在一種實(shí)施方式中，所述rna聚合酶β亞基含有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列。
14、在一種實(shí)施方式中，所述rna聚合酶β’亞基含有如seq?id?no.3所示的氨基酸序列。
15、在一種實(shí)施方式中，所述rna聚合酶亞基的氨基端通過第一連接肽與所述胞苷脫氨酶的羧基端連接。
16、在一種實(shí)施方式中，所述胞苷脫氨酶是載脂蛋白bmrna編輯復(fù)合物(apobec)家族脫氨酶?？蛇x但不限定的，所述apobec家族脫氨酶可以是apobec1脫氨酶、apobec2脫氨酶、apobec3a脫氨酶、apobec3b脫氨酶、apobec3c脫氨酶、apobec3d脫氨酶、apobec3f脫氨酶、apobec3g脫氨酶、apobec3h脫氨酶、或apobec4脫氨酶。在一種實(shí)施方式中，所述胞苷脫氨酶是活化誘導(dǎo)的脫氨酶(aid)。在一種實(shí)施方式中，所述胞苷脫氨酶是八目鰻cda1(pmcda1)脫氨酶。
17、在一種實(shí)施方式中，所述pmcda1胞苷脫氨酶的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
18、在一種實(shí)施方式中，所述核酸編輯工具還包括尿嘧啶糖基化酶抑制劑ugi；
19、所述尿嘧啶糖基化酶抑制劑ugi與所述融合蛋白各自單獨(dú)存在，或，所述尿嘧啶糖基化酶抑制劑ugi的氨基端通過第二連接肽與所述融合蛋白羧基端連接。
20、在一種實(shí)施方式中，所述尿嘧啶糖基化酶抑制劑ugi的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。
21、在一種實(shí)施方式中，所述rna聚合酶α亞基，β亞基，β’亞基，胞苷脫氨酶，或尿嘧啶糖基化酶抑制劑可以根據(jù)需要添加純化標(biāo)簽。所述純化標(biāo)簽可選但不限定的為：his標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、sumo標(biāo)簽、trx標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽、gst標(biāo)簽或gfp標(biāo)簽。所述標(biāo)簽可以連接在蛋白肽鏈的氨基端和/或羧基端。
22、在一種實(shí)施方式中，所述第一連接肽和第二連接肽相同或不同。對(duì)所述連接肽的長(zhǎng)度不做限定，可選為5～50肽。
23、在一種實(shí)施方式中，所述第一連接肽和第二連接肽由以下氨基酸中的一種或幾種組成：s、g、e、t、p、a?？蛇x的，所述第一連接肽的含有seq?id?no.6所示的氨基酸序列。所述第二連接肽含有seq?id?no.7所示的氨基酸序列。
24、本專利技術(shù)還提供了編碼任一所述的核酸編輯工具的多核苷酸。
25、在一種實(shí)施方式中，所述多核苷酸含有用于調(diào)節(jié)所述核酸編輯工具的編碼基因表達(dá)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)；所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)具有如seq?id?no.8所示的核苷酸序列。
26、在一種實(shí)施方式中，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)位于所述胞苷脫氨酶、rna聚合酶亞基或尿嘧啶糖基化酶抑制劑ugi編碼基因起始密碼子對(duì)應(yīng)的核苷酸序列的5’端。
27、本專利技術(shù)還提供了含有所述多核苷酸的載體。
28、在一種實(shí)施方式中，所述載體以質(zhì)粒pxmj19為出發(fā)載體。
29、本專利技術(shù)還提供了表達(dá)任一所述核酸編輯工具，或含有所述多核苷酸，或含有所述載體的細(xì)胞。
30、在一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包括微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。
31、在一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包括但不限于谷氨酸棒桿菌?？蛇x的，所述谷氨酸棒桿菌為c.glutamicum?atcc?13032。
32、本專利技術(shù)還提供了所述核酸編輯工具，或所述多核苷酸，或所述載體，或所述細(xì)胞的以下任一應(yīng)用：
33、(a)在制備用于核酸編輯的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
34、(b)在篩選耐氧化能力提升的谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用。
35、有益效果：
36、(1)本專利技術(shù)通過將胞苷脫氨酶與rna聚合酶亞基連接構(gòu)建核酸編輯工具，得到了一系列突變率提高的核酸編輯工具，其中pmcda1-α顯示出了最高的突變率，為2.72±0.37×10-6，是野生型的77.27倍。
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1.一種核酸編輯工具，其特征在于，所述核酸編輯工具包括以下組件：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸編輯工具，其特征在于，所述RNA聚合酶亞基的氨基端通過第一連接肽與所述胞苷脫氨酶的羧基端連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸編輯工具，其特征在于，所述胞苷脫氨酶為APOBEC家族脫氨酶、活化誘導(dǎo)的脫氨酶AID或pmCDA1脫氨酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸編輯工具，其特征在于，所述核酸編輯工具還包括尿嘧啶糖基化酶抑制劑UGI；
5.編碼權(quán)利要求1～4任一所述核酸編輯工具的多核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有用于調(diào)節(jié)所述核酸編輯工具的編碼基因表達(dá)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)；所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)具有如SEQ?ID?NO.8所示的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求5或6所述多核苷酸的載體。
8.表達(dá)權(quán)利要求1～4任一所述核酸編輯工具，或含有權(quán)利要求5或6所述多核苷酸，或含有權(quán)利要求7所述載體的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞包括谷氨酸棒桿菌。>
10.權(quán)利要求1～4任一所述核酸編輯工具，或權(quán)利要求5或6所述多核苷酸，或權(quán)利要求7所述載體，或權(quán)利要求8或9所述細(xì)胞的以下任一應(yīng)用：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種核酸編輯工具，其特征在于，所述核酸編輯工具包括以下組件：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸編輯工具，其特征在于，所述rna聚合酶亞基的氨基端通過第一連接肽與所述胞苷脫氨酶的羧基端連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸編輯工具，其特征在于，所述胞苷脫氨酶為apobec家族脫氨酶、活化誘導(dǎo)的脫氨酶aid或pmcda1脫氨酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸編輯工具，其特征在于，所述核酸編輯工具還包括尿嘧啶糖基化酶抑制劑ugi；
5.編碼權(quán)利要求1～4任一所述核酸編輯工具的多核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：饒志明，徐美娟，王晴，李懿琛，張顯，楊套偉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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