一種角膜后板層及其用途制造技術

本發明專利技術涉及一種角膜后板層。所述的角膜后板層由下列方法制得：（ａ）貓角膜內皮前體細胞的分離和培養，得到角膜內皮前體細胞；（ｂ）豬角膜脫細胞基質的制備，得到脫細胞基質；（ｃ）角膜后板層的構建。本發明專利技術還提供角膜后板層作為供體用于角膜移植。以角膜內皮前體細胞構建的組織工程角膜后板層，其結構與正常的角膜后板層結構近似。以角膜內皮前體細胞作為種子細胞構建角膜后板層，可以提供充足的細胞來源，克服角膜內皮細胞增殖能力低的難題，同時又不存在細胞轉化以及安全性的問題。

【技術實現步驟摘要】
一種角膜后板層及其用途
本專利技術涉及醫學和生物工程中的醫用材料領域，具體地說，是關于一種角膜后板層及其用途。
技術介紹
全世界每年約有100萬以上的患者因為角膜內皮細胞功能失代償而導致失明。穿 透性角膜移植術是目前取代病變或受損的角膜內皮細胞、恢復角膜透明性的主要治療方 法。雖然穿透性角膜移植的成功率較高，但是仍然受到了供體材料來源嚴重短缺、某些病例 發生的嚴重排斥反應以及術后造成的醫源性散光等問題的限制。近年來興起的后板層角膜 內皮移植術克服了穿透性角膜移植術的許多不足，但是仍然存在供體角膜缺乏的限制。在 美國，只有60%的供體角膜可以用于角膜移植，剩下的40%供體由于內皮細胞密度太低而不能使用。因此，體外擴增培養種子細胞構建組織工程角膜后板層以代替損傷的角膜內皮， 已成為當前的研究熱點，并有望解決角膜內皮移植供體不足的難題。 角膜由上皮層、前彈力層、基質層、后彈力層和內皮層組織構成。角膜組織含有三 種構成細胞角膜上皮細胞、基質細胞和內皮細胞。其中，前彈力層和后彈力層不含有細胞 成分。Tsai以羊膜組織為載體，選取患者健側角膜緣上皮組織約lmmXlmm體外培養，重建 受損傷的角膜表面6例。手術后l個月角膜表面上皮層重建，角膜透明度得到改善。術后 隨訪l年以上，其中5例患者視力由20/112上升至20/45，另l例由于化學燒傷至角膜完全 混濁的患者，視力從數指改善至20/200。隨訪期間，移植區域未有新生血管再生以及炎癥反 應?，F有技術中有如下的文獻報道將體外分離培養的兔角膜基質細胞接種到聚羥基乙酸 材料上，再回植到兔角膜基質層。術后8周，角膜逐漸恢復透明，移植的細胞-材料復合物 形成新生角膜基質樣組織。異種角膜脫細胞基質為載體，在其上皮面和內皮面分別接種兔 角膜上皮細胞和內皮細胞，體外培養2周，所構建的上皮_脫細胞基質載體_內皮復合物初 具角膜的雛形結構。以上研究成果都為體外構建角膜后板層提供了理論基礎和技術支持。 構建組織工程角膜后板層的一個必要條件就是要有健康的種子細胞。目前構建角 膜后板層的細胞主要來源于角膜本身。Maurice于1972年首次提出了將組織培養的角膜 內皮細胞移植到內皮細胞不健康的角膜上的設想，體外培養的角膜內皮細胞形態與活體類 似，具有分泌后彈力層樣物質、合成膠原、形成基底膜的能力。此外，被嘗試用于構建角膜后 板層的細胞還有胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞、血管內皮細胞等。Bednarz等將病毒癌基 因SV40轉染到角膜內皮細胞中，建立了永生細胞系。這些基因調控的內皮細胞不但可在體 外大量增殖，同時保留了正常內皮細胞的形態、結構和功能，在體外可形成多角形的單層內 皮層，且細胞表達內皮細胞的連接標志Z01和整聯蛋白Gl，尤其是角膜內皮細胞的泵功能 亦可檢測到。Joo等報道了將轉染了 SV40的鼠角膜內皮細胞移植到鼠角膜，觀察6周后仍 有90%的角膜維持透明。 角膜內皮細胞的培養已經有40多年的歷史。但是人角膜內皮細胞在體內不能增 殖，在體外多種生長因子的誘導下亦只能有限的增殖，長期培養較難實現。目前實驗中所用的動物大多為鼠或兔，而鼠和兔的角膜內皮細胞本身就存在著較強的增殖能力，其實驗結 果不具有代表性。胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞和血管內皮細胞等異位細胞接種到角膜 上，其表型轉化機制不明確，從而在功能上也不可能完全達到角膜內皮細胞的效果。通過轉 染SV40而建立的永生內皮細胞系，其應用也存在著安全性的問題。由于永生細胞持續分 裂，即使在達到一定的細胞密度后仍然不會停止分裂，過多的子代細胞脫落到前房，會阻塞 小梁網，同時也存在著致瘤的危險；基因轉染需要將病毒載體引入人體，目前并不清楚這些 載體是停留于局部還是遍布全身，同時也缺乏長期的觀察結果。
技術實現思路
本專利技術的目的是，提供一種角膜后板層。 本專利技術的再一的目的是，提供一種角膜后板層的用途。 為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案是一種角膜后板層，所述的角膜后板層 由下列方法制得 (a)、貓角膜內皮前體細胞的分離和培養，得到角膜內皮前體細胞； (b)、豬角膜脫細胞基質的制備，得到脫細胞基質； (C)、角膜后板層的構建。 所述的步驟(c)是將步驟(a)中的角膜內皮前體細胞制成5X 106/ml濃度的細胞 懸液，接種100 iU到步驟(b)中脫細胞基質的表面，構建角膜后板層。 所述的步驟(c)還包括將角膜后板層于37°C 5% C02飽和濕度培養箱中靜置2h， 再加入400 ii 1培養液，繼續培養。 所述的步驟(a)中用內皮細胞的Descemet膜與0. 2%復合膠原酶混合，內皮細胞 的Descemet膜與O. 2%復合膠原酶的體積比為1 : 5。 所述的步驟(a)中將角膜內皮細胞以lX10Vml的低濃度接種，經克隆培養而得 到的。 為實現上述第二個目的，本專利技術采取的技術方案是角膜后板層作為供體用于角 膜移植。 本專利技術優點在于本專利技術主要是從貓的角膜內皮細胞中分離并體外培養出前體細 胞，以角膜內皮前體細胞作為種子細胞接種到異種角膜脫細胞基質載體上，體外構建組織 工程角膜后板層。貓的角膜內皮細胞在體內不能增殖，提供了與人相似的生物學模型。角膜 內皮前體細胞作為角膜內皮細胞的未完全分化狀態，具有較強的增殖能力、自我更新能力 以及多向分化能力。以角膜內皮前體細胞構建的組織工程角膜后板層，其結構與正常的角 膜后板層結果近似。以角膜內皮前體細胞作為種子細胞構建角膜后板層，可以提供充足的 細胞來源，克服角膜內皮細胞增殖能力低的難題，同時又不存在細胞轉化以及安全性的問 題，可以為角膜內皮移植提供大量的供體。所構建的組織工程角膜后板層可用于模擬生理 性角膜進行生理、病理和藥理學的基礎研究，同時也可作為供體直接用于治療性角膜移植。附圖說明 圖1 :細胞接種后第3天形成克隆，即其中含有角膜內皮前體細胞。 圖2 :克隆體積不斷增大，至第10天左右達至穩態。 圖3 :傳代后細胞形成的克隆。 圖4 :免疫熒光化學染色表明角膜內皮前體細胞表達nestin。 圖5 :角膜脫細胞基質透明，維持一定的曲率。 圖6 :HE染色顯示角膜脫細胞基質結構致密。 圖7 :掃描電鏡下見角膜脫細胞基質表面平滑。 圖8 :透射電鏡觀察角膜脫細胞基質的縱切面，見膠原纖維排列整齊。 圖9 :HE染色顯示分化的單層角膜內皮前體細胞連續貼附于角膜脫細胞基質。 圖10 :透射電鏡觀察顯示分化的角膜內皮前體細胞貼附在角膜脫細胞基質上，細胞器豐富。具體實施方式下面結合附圖對本專利技術提供的一種角膜后板層及其用途的具體實施方式做詳細 說明。 實施例 —、貓角膜內皮前體細胞的分離和培養 將貓眼球經PBS清洗后放入消毒盤內。仔細分離結膜組織，小心刮除上皮，沿角 膜緣外lmm剪下角膜組織，置于匿EM/F12(1 : l)培養液中。用刀片輕輕刮除角膜上皮細 胞，用眼科鑷小心揭取含有內皮細胞的Descemet膜。將Descemet膜反復剪碎，加入0. 2% 復合膠原酶(Descemet膜組織塊與膠原酶的體積比約為1 : 5，組織塊與膠原酶的體積比 為1 : 5，可以達到既不浪費膠原酶，對細胞損傷小，又可以有效地消化Descemet膜，縮短 操作時間的優點。組織塊與膠原酶的體積比低于l : 5本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種角膜后板層，其特征在于，所述的角膜后板層由下列方法制得：（ａ）、貓角膜內皮前體細胞的分離和培養，得到角膜內皮前體細胞；（ｂ）、豬角膜脫細胞基質的制備，得到脫細胞基質；（ｃ）、角膜后板層的構建。

【技術特征摘要】
一種角膜后板層，其特征在于，所述的角膜后板層由下列方法制得(a)、貓角膜內皮前體細胞的分離和培養，得到角膜內皮前體細胞；(b)、豬角膜脫細胞基質的制備，得到脫細胞基質；(c)、角膜后板層的構建。2. 根據權利要求l所述的角膜后板層，其特征在于，所述的步驟(c)是將步驟(a)中的 角膜內皮前體細胞制成5X107ml濃度的細胞懸液，接種100ia到步驟(b)中脫細胞基質 的表面，構建角膜后板層。3. 根據權利要求2所述的角膜后板層，其特征在于，步驟(c)還包括將角膜后板層于 37°C 5...

【專利技術屬性】
技術研發人員：范先群，陸雯娟，傅瑤，
申請(專利權)人：上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]