【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及快速篩選及分析墊狀卷柏α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，屬于中藥活性成分提取及分析。
技術(shù)介紹
1、糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染等因素導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征[1]。研究表明，全球糖尿病成人患者從2000年的1.51億，預(yù)計到2035年將增長至5.92億[2]，目前已成為世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共健康問題，嚴(yán)重影響人民的生活質(zhì)量。
2、α-葡萄糖苷酶是一種消化酶，又被稱為麥芽糖酶[3]，人體消化道中食物經(jīng)α-葡萄糖苷酶分解釋放葡萄糖，提高機(jī)體餐后血糖濃度，形成糖尿病。而α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類通過抑制α-葡萄糖苷酶將多糖水解為單糖，延緩機(jī)體攝取葡萄糖達(dá)到治療糖尿病的口服降血糖藥物[4-5]。
3、阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇是三種臨床常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑，但患者長期服用會產(chǎn)生肝毒性、腹絞痛、脹氣等副作用[6]。現(xiàn)在國內(nèi)外學(xué)者希望從天然植物中找到新穎的、有效且安全的α-葡萄糖苷酶抑制劑[7]。
4、由于中藥化學(xué)成分類型繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致傳統(tǒng)的中藥藥效物質(zhì)篩選過程耗時長、溶劑用量大、效率低且容易丟失一些微量潛在藥效物質(zhì)[8-9]。近年來，以配體垂釣為代表的靶向垂釣技術(shù)，因能與色譜技術(shù)聯(lián)用而具有了快速篩選功能與結(jié)構(gòu)鑒定功能，特別適用于從中藥多組分的體系中篩分出潛在的藥物活性物質(zhì)[10]。
5、墊狀卷柏為卷柏科卷柏屬植物墊狀卷柏(selaginella?chaetoloma)的干燥全草，墊狀卷柏
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所要解決的是利用fe3o4合成氨基表面修飾的磁性納米粒，并通過交聯(lián)法獲得固定化酶。再用固定化酶與墊狀卷柏提取物溶液相作用，通過配體垂釣獲得墊狀卷柏提取物中的活性物質(zhì)。然后通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行判斷識別，最后測定這些活性成分的酶抑制活性，并運(yùn)用分子對接技術(shù)研究抑酶機(jī)理的技術(shù)問題。
2、為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、快速篩選及分析墊狀卷柏α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，包括如下步驟：
4、步驟一：取3mg固定化酶，加入150μl的0.1m,ph?7.4磷酸緩沖液混勻；
5、步驟二：取墊狀卷柏提取物溶液2ml加入其中，渦旋2min，于37℃孵育5h；
6、步驟三：孵育結(jié)束后利用外加磁場將固定化酶從上清液中小心分離；
7、步驟四：用2ml磷酸緩沖液對磁性納米粒洗滌3次；
8、步驟五：加入2ml甲醇，洗脫三次，磁吸分離固定化酶并收集上清液；
9、步驟六：上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后經(jīng)hplc進(jìn)行分離分析；分析后，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對比。
10、所述固定化酶為磁性納米粒固定化α-葡萄糖苷酶，其制備方法，包括如下步驟：
11、步驟一：稱取fe3o4?100mg于三頸燒瓶中，加入80％乙醇100ml，超聲分散10min；置三頸燒瓶于攪拌器上，攪拌過程中分別加入1.0ml氨水和1.0mlteos，室溫反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后磁吸分離，并用水和無水乙醇交替洗至中性；60℃真空干燥，即得fe3o4@sio2；
12、步驟二：稱取fe3o4@sio2?100mg于三頸燒瓶中，加入無水乙醇100ml，超聲分散10min；置三頸燒瓶于攪拌器上，攪拌過程中加入aptes?3.0ml，室溫反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后磁吸分離，并用水和無水乙醇交替洗滌3次；60℃真空干燥，即得中間體fe3o4@sio2-nh2；步驟三：稱取fe3o4@sio2-nh2?10mg于ep管中，分別加入2ml無水乙醇與0.1m，ph?7.4的pbs緩沖液，超聲分散20min；隨后加入50％戊二醛溶液400μl，渦旋混勻1min，振搖4h，37℃，25rpm；振搖結(jié)束后磁鐵磁吸棄去上清液，并用pbs緩沖液洗滌固形物3次，得戊二醛修飾后的磁性納米；將α-葡萄糖苷酶溶于0.10m?pbs緩沖液，加入表面醛基修飾的磁性納米粒，振搖，37℃，25rpm；振搖結(jié)束后磁鐵磁吸棄上清液，并用磷酸緩沖液洗滌固形物3次，得到磁性納米粒固定化α-葡萄糖苷酶，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>
13、所述墊狀卷柏提取物溶液的制備方法，包括如下步驟：
14、步驟一：取墊狀卷柏粉末20.0g，加入95％乙醇240ml回流2h，90℃，重復(fù)提取2次；
15、步驟二：提取液合并后減壓濃縮并用95％乙醇定容至100ml，得墊狀卷柏提取液。
16、采用上述技術(shù)方案的有益效果是：
17、本專利技術(shù)在功能化磁性納米粒子的合成及在天然抗α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選中的應(yīng)用。首先，利用單因素實驗篩選了固定化ag的最佳條件，提高了酶的固定化率。固定化酶通過磁性納米顆粒材料的表面修飾，比其他類型的材料更好地增強(qiáng)了底物親和力。接著，配體垂釣法的結(jié)果表明，固定化酶可以區(qū)分已知的ag配體和非配體。最后，采用配體垂釣法篩選出了墊狀卷柏提取物中的ag抑制劑，成功地發(fā)現(xiàn)了兩種潛在的抑制劑，并利用體外酶抑制實驗證明了活性化合物對ag的抑制作用。
18、建立的基于固定化酶的活性成分“垂釣”技術(shù)較為便捷地從墊狀卷柏提取物中篩選得到了ag抑制劑，為從其他天然藥物中篩選活性化合物提供一條研究途徑。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.快速篩選及分析墊狀卷柏α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，其特征在于：它包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速篩選及分析墊狀卷柏α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，其特征在于：所述固定化酶為磁性納米粒固定化α-葡萄糖苷酶，其制備方法，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速篩選及分析墊狀卷柏α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，其特征在于：所述墊狀卷柏提取物溶液的制備方法，包括如下步驟：
【技術(shù)特征摘要】
1.快速篩選及分析墊狀卷柏α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，其特征在于：它包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述快速篩選及分析墊狀卷柏α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，其特征在于：所述固定化酶為磁性納...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔣永梅，王剛，張成江，高瓊，彭丹麗，
申請(專利權(quán))人：遵義醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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