【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體而言，涉及一種結合trop2蛋白的核酸適配體及其應用。
技術介紹
1、滋養層細胞表面抗原2(trop2)是人類細胞中的一種單拷貝基因編碼在多種惡性腫瘤中過表達的1型跨膜糖蛋白，是一種與惡性腫瘤發生、侵襲和轉移有關的癌基因編碼蛋白，屬于tacstd家族，是由tacstd2基因編碼表達的細胞表面糖蛋白，又名腫瘤相關鈣離子信號轉導子2(tacstd2)、表皮糖蛋白1(egp-1)、胃腸腫瘤相關抗原(ga733-1)、表面標志物1(m1s1)。
2、trop-2與上皮細胞粘附分子(epcam)有關，又被稱為trop-1、gp40和ksa。trop-1和trop-2是與血清igf-ii結合蛋白同源的信號轉導蛋白。因此，它們可能是一種新的細胞表面受體，并可能在調節癌細胞的生長中發揮作用。
3、trop2在多種上皮癌，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤中都有大量表達，其過度表達與預后不良和轉移風險增加有關。trop2在正常組織中表達有限，能夠有效降低潛在治療毒性，在不同種類的實質瘤病患體內，此蛋白的過表達通常預示腫瘤的預后不良。在膽囊癌、腸胃癌、肝門部膽管癌和胰腺癌病癥的案例中，trop2高表達病患者的生存率明顯下降。鑒于trop2在多種癌癥中的高表達性，以及其對病患生存率的顯著影響，此蛋白被認為是一個潛在的腫瘤治療靶點。
4、核酸適配體(aptamer)是指通過指數富集的配基系統進化技術(selex)篩選分離得到的dna或者rna分子，它可以與其他靶標如
5、因此，急需找到一種針對trop2蛋白的結合親和力高，特異性好，易于修飾和人工合成，穩定性好，使用便利的核酸適配體。
技術實現思路
1、為彌補已有技術的缺陷，本專利技術提供一種結合trop2蛋白的核酸適配體及其應用，通過改進篩選條件，篩選獲得一種分子量小、化學性質穩定、易于保存和標記的能夠以高親和力結合trop2蛋白的核酸適配體，并具有非常好的特異性，可用于檢測、診斷、成像以及治療等方面，應用前景廣闊。
2、一方面，本專利技術提供了一種結合trop2蛋白的核酸適配體，所述核酸適配體具有如seq?id?no.1～seq?id?no.6中的任一項所示的核苷酸序列；或與seq?id?no.1～seq?idno.6中的任一項具有至少30％同源性且結合trop2蛋白的核苷酸序列；或由如seq?id?no.1～seq?id?no.6中的任一項所示的核苷酸序列轉錄的rna序列。
3、本專利技術人基于selex技術，設計并合成了一個隨機單鏈dna文庫和相應的引物，用來篩選具有分子量小、化學性質穩定、易于保存和標記的能夠以高親和力結合trop2蛋白的核酸適配體，由此篩選得到一些高親和力結合trop2蛋白的核酸適配體，分別為asczz-trop2--01(seq?id?no.1)、asczz-trop2--02(seq?id?no.2)、asczz-trop2--10(seq?idno.3)、asczz-trop2--17(seq?id?no.4)、asczz-trop2--25(seq?id?no.5)、asczz-trop2--26(seq?id?no.6)該核酸適配體與trop2蛋白具有較高的親和力，且具有較高的特異性。
4、可以理解的是，與本專利技術提供的核酸適配體具有至少30％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性且結合trop2蛋白的核苷酸序列，例如可將上述核酸適配體的任一個所示的核苷酸序列刪除部分序列或增加部分序列，依然具有與trop2蛋白的高親和力，依然在本專利技術的保護范圍內。
5、在一些方式中，作為對上述技術方案的改進，可對上述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置進行修飾，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，條件是這樣修飾后得到的核酸適配體序列具有合乎需要的性質，例如，可以具有與修飾前的母體核酸適配體序列相等或更高的結合trop2蛋白的親和力，或雖然親和力沒有明顯提升但是具有更高的穩定性。
6、所以，在一些實施方案中，所述核酸適配體的核苷酸序列被修飾且修飾后的核酸適配體特異性結合trop2蛋白，所述修飾選自磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一種，依然在本專利技術的保護范圍內。
7、進一步地，所述核酸適配體具有如seq?id?no.1、seq?id?no.4中的任一項所示的核苷酸序列。
8、另一方面，本專利技術提供了一種核酸適配體的綴合物或衍生物，所述核酸適配體具有如seq?id?no.1～seq?id?no.6中的任一項所示的核苷酸序列；所述核酸適配體的綴合物包括熒光標記物；所述核酸適配體的衍生物包括由核酸適配體或核酸適配體的綴合物的核苷酸序列骨架改造成的結合trop2蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。
9、本專利技術所述的核酸適配體的綴合物，是指在核酸適配體上連接其他基團，比如可以連接具有標志作用的熒光標記物，例如fam、放射性物質、治療性物質、生物素、地高辛、納米發光材料、小肽、sirna或酶標記等，使修飾后得到的核酸適配體序列具有合乎需要的性質，例如，可以具有與修飾前的母體核酸適配體序列相等或更高的結合trop2蛋白的親和力，或雖然親和力沒有明顯提升但是具有更高的穩定性。
10、換言之，以上不論是經部分取代或經過修飾后的核酸適配體，都具有原核酸適配體基本相同或類似的分子結構、理化性質和功能，都可應用于與trop2蛋白的結合。
11、此外，本專利技術還提供核酸適配體衍生物，所述衍生物是由上述核酸適配體的核苷酸序列的骨架改造成結合trop2蛋白的硫代磷酸酯骨架而得，或者是前述任一項技術方案中所述核酸適配體或核酸適配體的綴合物改造成的結合trop2蛋白的肽核酸。條件是所述衍生物都具有與原核酸適配體基本相同或類似的分子結構、理化性質和功能，且都與trop2蛋白結合。
12、本專利技術所使用的術語“硫代磷酸酯骨架”具有本領域普通技術人員一般理解的含義，其是指rna和dna核酸適配體的磷酸二酯骨架的非橋鍵氧原子可以被一個或兩個硫原子取代，分別產生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鍵的硫代磷酸酯骨架。已知這樣的硫代磷酸酯骨架具有增加的對其靶標的結合親和力，以及對核酸酶降解的增強的抗性。
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1.一種結合Trop2蛋白的核酸適配體，其特征在于，具有如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.6中的任一項所示的核苷酸序列；或與SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.6中的任一項具有至少30％同源性且結合Trop2蛋白的核苷酸序列；或由如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.6中的任一項所示的核苷酸序列轉錄的RNA序列。
2.如權利要求1所述的核酸適配體，其特征在于，具有如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.4中的任一項所示的核苷酸序列。
3.一種核酸適配體的綴合物或衍生物，其特征在于，所述核酸適配體具有如SEQ?IDNO.1～SEQ?ID?NO.6中的任一項所示的核苷酸序列；所述核酸適配體的綴合物包括熒光標記物；所述核酸適配體的衍生物包括由核酸適配體或核酸適配體的綴合物的核苷酸序列骨架改造成的結合Trop2蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。
4.如權利要求3所述的核酸適配體的綴合物或衍生物，其特征在于，所述核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.4中的任一項所示的核苷酸序列。
5.一種檢
6.一種純化Trop2蛋白的產品，其特征在于，包括如權利要求1或2所述的核酸適配體，或權利要求3或4所述的核酸適配體的綴合物或衍生物；所述產品包括試劑盒、檢測芯片、層析檢測裝置中的任意一種或多種。
7.一種結合Trop2蛋白的核酸適配體的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的在第5輪以后添加血清，具體過程為：第5輪添加10％血清，第6輪添加20％血清；所述血清為正常人血清。
9.如權利要求1或2所述的核酸適配體，或權利要求3或4所述的核酸適配體的綴合物或衍生物用于制備檢測或純化Trop2蛋白的試劑的用途。
10.如權利要求1或2所述的核酸適配體，或權利要求3或4所述的核酸適配體的綴合物或衍生物用于制備靶向到Trop2蛋白的藥物的用途。
...【技術特征摘要】
1.一種結合trop2蛋白的核酸適配體，其特征在于，具有如seq?id?no.1～seq?id?no.6中的任一項所示的核苷酸序列；或與seq?id?no.1～seq?id?no.6中的任一項具有至少30％同源性且結合trop2蛋白的核苷酸序列；或由如seq?id?no.1～seq?id?no.6中的任一項所示的核苷酸序列轉錄的rna序列。
2.如權利要求1所述的核酸適配體，其特征在于，具有如seq?id?no.1、seq?id?no.4中的任一項所示的核苷酸序列。
3.一種核酸適配體的綴合物或衍生物，其特征在于，所述核酸適配體具有如seq?idno.1～seq?id?no.6中的任一項所示的核苷酸序列；所述核酸適配體的綴合物包括熒光標記物；所述核酸適配體的衍生物包括由核酸適配體或核酸適配體的綴合物的核苷酸序列骨架改造成的結合trop2蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。
4.如權利要求3所述的核酸適配體的綴合物或衍生物，其特征在于，所述核酸適配體具有如seq?id?no.1、seq?id?no.4中的任一項所示的核苷酸序列。...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張崢，譚蔚泓，羅昭鋒，孫洋，刁寒，呂少康，吳金夢，
申請(專利權)人：中國科學院杭州醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
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