【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫用材料領域，尤其涉及促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法及應用。
技術介紹
1、缺血性心臟病發生過程中，梗死周圍邊界區的殘余缺血會導致心肌細胞進一步受損，導致收縮功能進行性下降，因此心肌梗死后的促血管新生治療具有重大的臨床治療意義。
2、目前心梗治療主要圍繞及時恢復血供、改善缺血缺氧以減少心肌壞死，治療手段主要包括藥物溶栓、血管支架介入、冠脈旁路移植術和心臟移植等。然而，這些治療手段均無法逆轉心肌梗死和心功能的進一步惡化。此外，還存在心臟移植供體來源短缺、術后易出現免疫排斥等問題。近年來，利用組織工程原理構建的工程化心臟貼片具有重建心肌再生微環境和修復心肌梗死的潛力。
3、作為搭載組織工程學心臟貼片的核心治療部件，以外泌體為代表的無細胞療法以其高效力，低免疫原性被廣泛認可。使用不同類型細胞的外泌體均展現出不同程度的療效，目前涉及治療效力的外泌體如干細胞外泌體，內皮細胞外泌體，均存在治療覆蓋范圍廣，但對心肌梗死后促血管新生的療效不確切不深入的問題，且現有外泌體所來源的細胞系培育難度大，提取效率低，無法應對應用轉化的批量生產。
技術實現思路
1、為解決現有心臟貼片搭載的外泌體促血管新生療效不確切，培育難度大無法應對批量生產的問題，本專利技術提供了促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法及應用。
2、本專利技術的技術方案：
3、一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片
4、進一步的，所述心臟貼片中腫瘤源外泌體的質量百分含量為0.5％。
5、進一步的，所述腫瘤源外泌體包括卵巢癌caov-3細胞系來源的外泌體和/或卵巢癌ov-90細胞系來源的外泌體。
6、一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，步驟如下：
7、步驟一、腫瘤細胞的復蘇和傳代：
8、將腫瘤細胞接種于復蘇培養基中進行復蘇培養，細胞融合度達到傳代要求后，用胰蛋白酶消化所得腫瘤細胞后進行傳代擴增；
9、步驟二、腫瘤細胞的無外泌體血清培養：
10、以去除外泌體的胎牛血清配置無外泌體血清專用培養基，將步驟一擴增所得腫瘤細胞接入所述無外泌體血清專用培養基進行72h無外泌體血清培養；
11、步驟三、收集腫瘤細胞：
12、收集步驟二已培養72h的腫瘤細胞培養液，通過兩步離心去除死細胞、雜質及細胞碎片，收集細胞上清液；
13、步驟四、收集腫瘤源外泌體：
14、將步驟三收集的細胞上清液進行超速離心沉降外泌體，用緩沖液重懸所得外泌體并離心提純，得到腫瘤源外泌體。
15、進一步的，步驟一所述腫瘤細胞為卵巢癌caov-3細胞或卵巢癌ov-90細胞。
16、進一步的，步驟一所述復蘇培養基為1640ripm+10％v/v胎牛血清+1％v/v雙抗；所述復蘇培養是在37℃、co2體積百分含量為5％的條件下培養。
17、進一步的，步驟一所述細胞融合度為75～85％，所述胰酶為0.25％w/v胰蛋白酶溶液，消化時間為1min；所述傳代擴增的傳代比例為1:3。
18、進一步的，步驟二所述去除外泌體的胎牛血清是將胎牛血清于4℃，120000g超速離心16h，去除血清中富含的外泌體獲得的；所述無外泌體血清專用培養基為1640ripm+5％v/v去除外泌體的胎牛血清+1％v/v雙抗；所述無外泌體血清培養的傳代比例為1:5，培養條件為co2體積百分含量為5％的條件下，37℃溫度下培養。
19、進一步的，步驟三所述兩步離心為先以300g離心10min去除死細胞及雜質，再以2000g離心10min去除細胞碎片。
20、進一步的，步驟四所述超速離心為120000g離心90min，所述離心提純為120000g離心90min。
21、本專利技術的有益效果：
22、本專利技術創造性的將腫瘤細胞侵襲遷移的促血管生成的病理機制反向整合到促進梗死部位血管生成的治療機制，將腫瘤細胞強大、刺激、持久刺激新生血管生成的能力進行有效利用。
23、本專利技術通過試驗證實，腫瘤源外泌體中se-cad蛋白(可溶性e-鈣黏蛋白)能與內皮細胞的vegfr2位點結合發揮類vegf的作用，此種外泌體還具有促進vegfr2表達的能力，這兩種能力使腫瘤源外泌體促內皮細胞成管能力大于已知促血管生成的最高效力經典因子vegf，具有促血管生成的確切療效。而且腫瘤細胞具有培育簡單、擴增迅速、腫瘤源外泌體收集率突出的特點，能夠滿足轉化應用和批量生產的要求。
24、本專利技術利用腫瘤源外泌體具有促血管生成的特點，將其提取轉化為治療缺血性心臟病的關鍵治療因子，通過搭載組織工程學心臟貼片的方式，能夠有效解決心肌梗死治療中不完全血管化及微循環障礙而導致的頑固性心衰、心肌梗死復發等問題，降低缺血性心臟病的復發率和病死率。
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1.一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應用。
2.根據權利要求1所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應用，其特征在于，所述心臟貼片中腫瘤源外泌體的質量百分含量為0.5％。
3.根據權利要求1或2所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應用，其特征在于，所述腫瘤源外泌體包括卵巢癌Caov-3細胞系來源的外泌體和/或卵巢癌OV-90細胞系來源的外泌體。
4.一種權利要求1-3任一所述的促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟如下：
5.根據權利要求4所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述腫瘤細胞為卵巢癌Caov-3細胞或卵巢癌OV-90細胞。
6.根據權利要求4或5所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述復蘇培養基為1640RIPM+10％v/v胎牛血清+1％v/v雙抗；所述復
7.根據權利要求6所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述細胞融合度為75～85％，所述胰酶為0.25％w/v胰蛋白酶溶液，消化時間為1min；所述傳代擴增的傳代比例為1:3。
8.根據權利要求7所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟二所述去除外泌體的胎牛血清是將胎牛血清于4℃，120000G超速離心16h，去除血清中富含的外泌體獲得的；所述無外泌體血清專用培養基為1640RIPM+5％v/v去除外泌體的胎牛血清+1％v/v雙抗；所述無外泌體血清培養的傳代比例為1:5，培養條件為CO2體積百分含量為5％的條件下，37℃溫度下培養。
9.根據權利要求8所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟三所述兩步離心為先以300G離心10min去除死細胞及雜質，再以2000G離心10min去除細胞碎片。
10.根據權利要求9所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟四所述超速離心為120000G離心90min，所述離心提純為120000G離心90min。
...【技術特征摘要】
1.一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應用。
2.根據權利要求1所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應用，其特征在于，所述心臟貼片中腫瘤源外泌體的質量百分含量為0.5％。
3.根據權利要求1或2所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應用，其特征在于，所述腫瘤源外泌體包括卵巢癌caov-3細胞系來源的外泌體和/或卵巢癌ov-90細胞系來源的外泌體。
4.一種權利要求1-3任一所述的促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟如下：
5.根據權利要求4所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述腫瘤細胞為卵巢癌caov-3細胞或卵巢癌ov-90細胞。
6.根據權利要求4或5所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述復蘇培養基為1640ripm+10％v/v胎牛血清+1％v/v雙抗；所述復蘇培養是在37℃、co2體積百分含量為5％的條...
【專利技術屬性】
技術研發人員：康凱，孫昊博，展旭，解萬東，秦思達，靳元，孫哲，張金鳳，
申請(專利權)人：哈爾濱醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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