【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及蛋白組學，具體涉及一種基于蛋白變性形成納米蛋白冠的制備方法及其在鑒定低豐度蛋白中的應用。
技術介紹
1、血液成分復雜，高豐度蛋白占血清蛋白總數的90％以上，高豐度與低豐度之間跨越了10個數量級以上。癌癥標志物蛋白往往屬于低豐度蛋白，但是其檢測常受到高豐度蛋白的干擾，這在一定程度上限制了血清蛋白質組鑒定深度的提升。目前市面上的商用試劑盒，如去白蛋白試劑盒和去14種高豐度蛋白的試劑盒(例如themo公司的pierce?albumindepletion?kit和high-select?top14?abundant?protein?depletion?spin?columns)可以起到提升蛋白鑒定深度的效果，但是其成本較高，低豐度蛋白的檢出量也有待進一步提高。
2、二氧化硅納米顆粒在去除血清高豐度蛋白中可產生與商用試劑盒相同的效果。尤其是分級之后，可以大幅提升鑒定蛋白的數量。但是分級的工作流程較為復雜，因此，目前需要開發一種新的方法以提高血清蛋白質組學的鑒定深度。
3、質譜技術的不斷創新對蛋白質組學的深入研究起到了關鍵作用，以捕集離子淌度飛行時間質譜(timstof?ms)為代表的高分辨率質譜儀器可以提高蛋白鑒定的靈敏度、準確性和速度。目前納米蛋白質組學鑒定深度的研究角度主要是從納米顆粒的粒徑、彈性、表面修飾、手性等方面展開的。
4、當納米粒子(nps)進入生物液體時，蛋白質會自發吸附在納米粒子表面，形成蛋白質層，即蛋白冠(pc)。蛋白冠的形成改變了納米粒子的生物特性，并影響其在體內的命
5、肺癌是全球致死率最高的癌癥，其中非小細胞肺癌約占所有肺癌類型85％。肺癌的預后與發現時腫瘤的分期密切相關，5年生存率從ia期的92％到iv期的0-10％不等。雖然低劑量計算機斷層掃描(ldct)能顯著降低20％的肺癌死亡率，但它存在高的假陽性和輻射暴露等問題。此外，由于惡性結節和良性結節具有相似的成像特征，導致它們難以區分。血清蛋白組學準確微創，能夠識別早期惡性和良性病變，但是基于血液的早期癌癥檢測面臨挑戰，即各種液體活檢分析物的濃度極低，需要大量樣本(10-15ml)來富集這些分析物。
6、因此，目前迫切需要開發便捷、無創的篩查技術提高早期肺癌鑒別的準確性，在最初發現時將惡性結節與大多數良性結節區分開來。
技術實現思路
1、目前一般采用分級、免疫親和耗竭或使用商業試劑盒、或改變納米顆粒的表面性質來提升血清蛋白質組學的鑒定深度，但分級、免疫親和耗竭、商業試劑盒操作過程復雜，經濟成本高；傳統液體活檢技術對液體的需求量大，需要10-15ml；通過改變納米顆粒的性質提升血清蛋白質組鑒定深度，但是部分低豐度蛋白容易和高豐度蛋白結合，仍然難以被質譜儀檢測到。針對現有技術中存在的至少一個不足，本專利技術利用納米蛋白冠在提升血清蛋白組學鑒定深度中的獨特優勢，創新性地通過變性劑改變蛋白結構后與納米顆粒相互作用進而檢測出了更多低豐度蛋白，顯著提升了血清蛋白組學的鑒定深度，可實現良性和惡性肺結節的早期診斷。
2、為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、本專利技術的第一個方面是提供一種基于蛋白變性的納米蛋白冠，其由通過變性劑改變待測樣本中的蛋白結構后與納米顆粒相互作用形成。
4、進一步地，所述變性劑包括乙腈、尿素和rapigest?sf中的至少一種。
5、進一步地，所述納米顆粒為磁性納米顆?；騭io2?nps。優選，所述磁性納米顆粒為fe3o4@sio2?nps，可理解的是，上述納米顆粒可采用本領域常規使用的其他磁性納米顆粒。
6、進一步地，所述待測樣本選自血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、乳液、蛋清或細胞上清液。
7、進一步地，所述待測樣本為血清，所述變性劑為乙腈，所述納米顆粒為fe3o4@sio2nps；所述待測樣本、乙腈與納米顆粒的用量比為5～200μl：1～100μl：0.5-5mg；優選地，所述待測樣本、乙腈與納米顆粒的用量比為5～100μl：2～8μl：0.5-2mg；更優選地，所述待測樣本、乙腈與納米顆粒的用量比為20μl：6μl：1mg。
8、進一步地，所述待測樣本為血清，所述變性劑為尿素，所述納米顆粒為fe3o4@sio2nps；基于所述待測樣本，所述尿素的濃度為0.1～12m，所述待測樣本與納米顆粒的用量比為5～200μl：0.5-5mg；優選地，基于所述待測樣本，所述尿素的濃度為2～10m，所述待測樣本、尿素與納米顆粒的用量比為5～100μl：0.5-2mg；更優選地，基于所述待測樣本，所述尿素的濃度為4m，所述待測樣本、尿素與納米顆粒的用量比為20μl：1mg；
9、進一步地，所述待測樣本為血清，所述變性劑為rapigest?sf，所述納米顆粒為fe3o4@sio2?nps；所述待測樣本、rapigest?sf與納米顆粒的用量比為5～200μl：1～200μl：0.5-5mg；優選地，所述待測樣本、rapigest?sf與納米顆粒的用量比為5～100μl：4～16μl：0.5-2mg；更優選地，所述待測樣本為血清，所述變性劑為rapigest?sf，所述待測樣本、rapigest?sf與納米顆粒的用量比為20μl：8μl：1mg。
10、本專利技術的第二個方面是提供一種本專利技術的第一個方面中任一所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠的制備方法，其包括步驟：在待測樣本中加入變性劑至預定濃度，使變性劑與樣本混合；變性結束后，向變性的待測樣本中加入預定量的納米顆粒nps；孵育結束后，將待測樣本放在磁性收集裝置上吸附nps，清洗nps以獲得所述基于蛋白變性的納米蛋白冠。
11、進一步地，所述制備方法具體包括步驟：向20μl血清樣本中加入乙腈、尿素或rapigest?sf，將變性劑與血清樣本混合(優選采用混勻器進行混合混勻3s-30min)，其中乙腈的濃度為10～40v％(例如10v％、20v％、30v％、40v％，最優選30v％)，rapigest?sf的濃度為20～80v％(例如20v％、40v％、60v％、80v％，最優選40v％)，尿素的濃度為2～10m(例如2m、4m、8m、10m，最優選4m)；變性結束后，添加去離子水使血清樣本的終體積為50μl，并向血清樣本中加入50μl濃度為20mg/ml的fe3o4@sio2?nps，孵育10min～2h；孵育結束后，將血清樣本放在磁性收集裝置上3～10min(優選5min)吸附nps，用nacl溶液洗滌nps(具體可采用300μl?150mm?nacl溶液洗滌蛋白質冠三次)，進行磁分離以獲得所述基于蛋白變性的納米蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述納米蛋白冠由通過變性劑改變待測樣本中的蛋白結構后與納米顆粒相互作用形成；其中，所述變性劑包括乙腈、尿素和RapiGest?SF中的至少一種，所述納米顆粒為磁性納米顆粒或SiO2?NPs，所述待測樣本選自血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、乳液、蛋清或細胞上清液。
2.根據權利要求1所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述納米顆粒為Fe3O4@SiO2?NPs。
3.根據權利要求1所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述待測樣本為血清，所述變性劑為乙腈，所述納米顆粒為Fe3O4@SiO2?NPs；所述待測樣本、乙腈與納米顆粒的用量比為5～200μL：1～100μL：0.5-5mg；
4.根據權利要求1所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述待測樣本為血清，所述變性劑為乙腈，所述納米顆粒為Fe3O4@SiO2?NPs；所述待測樣本、乙腈與納米顆粒的用量比為20μL：6μL：1mg；
5.一種如權利要求1～4中任一所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠的制備方法，其特征在于，包
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體包括步驟：向20μL血清樣本中加入乙腈、尿素或RapiGest?SF，將變性劑與血清樣本混勻3s-30min，其中乙腈的濃度為10～40v％，RapiGest?SF的濃度為20～80v％，尿素的濃度為2～10M；變性結束后，添加去離子水使血清樣本的終體積為50μL，并向血清樣本中加入50μL濃度為20mg/mL的Fe3O4@SiO2?NPs，孵育10min～2h；孵育結束后，將血清樣本放在磁性收集裝置上3～10min吸附NPs，用NaCl溶液洗滌NPs，進行磁分離以獲得所述基于蛋白變性的納米蛋白冠。
7.一種采用基于蛋白變性的納米蛋白冠鑒定低豐度蛋白的方法，其特征在于，包括：
8.根據權利要求7所述的鑒定低豐度蛋白的方法，其特征在于，采用所述鑒定低豐度蛋白的方法建立肺癌納米蛋白組學數據庫，篩選獲得用于區分健康、良性、惡性肺結節的關鍵蛋白和/或差異蛋白。
9.根據權利要求8所述的鑒定低豐度蛋白的方法，其特征在于，所述關鍵蛋白和/或差異蛋白包括：CFHR3、SLC4A1、APOC3、APP、TIMP1、CPB2、MSN、SPTB、RNF125、PAMR1、CP、EXT1、CCN2、NCAM1、CDH5、NPNT、ITGA11、TNXB、PTPRC、SLITRK4、NAGLU、FUCA2、PLAT、PROC、F10、F7、DEFA3、CFB、DEFA5、CTSG、HSPA1A、ASAP1、C4BPB、C4BPA、ELANE。
10.一種關鍵蛋白和/或差異蛋白在制備用于區分健康、良性、惡性肺結節的產品中的應用，其特征在于，所述產品為檢測關鍵蛋白和/或差異蛋白表達水平的試劑或試劑盒，所述關鍵蛋白和/或差異蛋白為由權利要求8或9所述的方法篩選獲得的用于區分健康、良性、惡性肺結節的關鍵蛋白和/或差異蛋白。
...【技術特征摘要】
1.一種基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述納米蛋白冠由通過變性劑改變待測樣本中的蛋白結構后與納米顆粒相互作用形成；其中，所述變性劑包括乙腈、尿素和rapigest?sf中的至少一種，所述納米顆粒為磁性納米顆?；騭io2?nps，所述待測樣本選自血清、血漿、尿液、腦脊液、唾液、乳液、蛋清或細胞上清液。
2.根據權利要求1所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述納米顆粒為fe3o4@sio2?nps。
3.根據權利要求1所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述待測樣本為血清，所述變性劑為乙腈，所述納米顆粒為fe3o4@sio2?nps；所述待測樣本、乙腈與納米顆粒的用量比為5～200μl：1～100μl：0.5-5mg；
4.根據權利要求1所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠，其特征在于，所述待測樣本為血清，所述變性劑為乙腈，所述納米顆粒為fe3o4@sio2?nps；所述待測樣本、乙腈與納米顆粒的用量比為20μl：6μl：1mg；
5.一種如權利要求1～4中任一所述的基于蛋白變性的納米蛋白冠的制備方法，其特征在于，包括步驟：在待測樣本中加入變性劑至預定濃度，使變性劑與樣本混合；變性結束后，向變性的待測樣本中加入預定量的納米顆粒nps；孵育結束后，將待測樣本放在磁性收集裝置上吸附nps，清洗nps以獲得所述基于蛋白變性的納米蛋白冠。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體包括步驟：向20μl血清樣本中加入乙腈、尿素或rapigest?sf，將變性劑與血清樣本混勻3s-30min，其中乙腈的濃度為10～40v...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚蔚泓，劉遠，解月麗，
申請(專利權)人：中國科學院杭州醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
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