【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物，具體涉及一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法。
技術介紹
1、布拉氏酵母菌(saccharomyces?boulardii)作為釀酒酵母菌的亞種，最早從荔枝中分離得到。前期研究表明，布拉氏酵母菌可以促進腸上皮細胞的增殖、成熟以及絨毛增長，維持宿主胃腸道微生態平衡，抗毒止瀉，增強非特異性免疫，保護腸道黏膜屏障并穩定腸道內環境，提高人和動物機體對營養物質的消化吸收能力，因此被鑒定為一種益生菌。然而，目前布拉氏酵母菌的胃腸道脅迫耐受機制尚未被研究報道，充分揭示其胃腸道脅迫抗逆機制，并利用生物技術手段增強其胃腸道脅迫耐受性，有利于進一步提高布拉氏酵母菌的應用效率，即在保證高存活率的同時減少外源益生菌的體外攝入量。因此，提高布拉氏酵母菌在胃腸道脅迫條件下的生長性能具有重要意義。
2、目前，提高益生菌胃腸道脅迫條件下的存活率的方法主要是通過生物活性物質包埋處理、分子生物技術改造等方法，例如利用多糖等物質將益生菌包埋制成膠囊，以提高其被服用后在人體內胃腸道脅迫環境下的存活率。分子生物學技術改造包括通過基因工程手段對益生菌進行改造，例如基因敲除、基因過表達、基因編輯(如crispr-cas9)等，對微生物的定向改造以提高其脅迫抗性，但基因改造后的益生菌仍然存在一定的安全隱患，需要嚴格的評估才能應用，且改造技術本身存在一定的技術難度和成本。目前利用微生物預處理的方法提高其抵御胃腸道脅迫的生理特性，從而其在胃腸道脅迫條件下存活率的研究甚少，本專利具有重要的研究意義及應用價值。
技術實現思路
1、針對現有提高布拉氏酵母菌在胃腸道脅迫條件下存活率方法操作過程復雜、成本高、成活率低的技術問題，本專利技術旨在于提供一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法。
2、為了達到上述目的，本專利技術采用以下技術方案予以實現：
3、本專利技術提供一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，包括：
4、s1，制備布拉氏酵母菌種子液；
5、s2，將步驟s1布拉氏酵母菌種子液接種至預培養液中于18℃～22℃預培養冷處理22h～26h，靜置獲得預培養后的布拉氏酵母菌；
6、s3，將步驟s2預培養后的布拉氏酵母菌進行體外脅迫處理，脅迫處理后離心收集菌體，獲得脅迫條件下存活率高的布拉氏酵母菌；
7、所述預培養液的組成為酵母膏8g/l～12g/l，蛋白胨18g/l～22g/l，葡萄糖18g/l～22g/l，月桂酸18μg/ml～24μg/ml，余量為水，ph為5.8～6.2。
8、所述s1制備布拉氏酵母菌種子液，布拉氏酵母菌按照體積百分比4％～6％添加。
9、所述s1制備布拉氏酵母菌種子液，培養基組成為：10g/l酵母膏，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，ph為6.0。
10、所述步驟s2布拉氏酵母菌種子液按照體積百分比4％～6％接種量接種。
11、所述步驟s3體外脅迫處理，預培養后的布拉氏酵母菌按照體積百分比4％～6％添加，脅迫處理為：人工胃液處理后進行人工腸液處理。
12、所述人工胃液中胃蛋白酶10g/l，ph為2.5；人工胃液培養條件為37℃處理1h。
13、所述人工腸液組成為：胰蛋白酶10g/l，豬膽鹽3g/l，kh2po413.6?g/l，ph為6.8；人工腸液培養條件為37℃處理2h。
14、實現上述預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下存活率的方法的預培養液，所述預培養液的組成為酵母膏8g/l～12g/l，蛋白胨18g/l～22g/l，葡萄糖18g/l～22g/l，月桂酸18μg/ml～24μg/ml，余量為水，ph為5.8～6.2。
15、所述預培養液組成為酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，月桂酸20μg/ml，余量為水，ph為6.0。
16、上述預培養液在提高益生菌脅迫條件下存活率中的應用。
17、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
18、本專利技術提供的一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，通過預培養配合冷處理(18℃～22℃)，提高細胞在后續脅迫條件下的耐受性和存活率；冷處理通過減緩細胞代謝速率，增加細胞膜的穩定性；預培養液有助于其在預培養階段快速生長并積累足夠的能量和物質儲備，預培養聯合冷處理，使細胞在脅迫條件下活性氧ros降低，從而提高布拉氏酵母菌對胃腸道中胃酸、膽鹽等脅迫因素的耐受性，這種協同作用顯著提高了酵母菌在胃腸道模擬環境中的存活率；本專利技術提供的方法簡單易行，只需要在接種至脅迫條件前對布拉氏酵母菌進行預培養且冷處理即可。同時，所使用的培養液成分簡單、成本較低，易于大規模應用，對于拓展布拉氏酵母菌作為益生菌在食品、醫藥等領域的應用具有重要意義。
19、本專利技術提供的預培養液，培養液成分簡單、成本較低，適合大規模應用，為布拉氏酵母菌提供了豐富的營養，有助于其在預培養階段快速生長并積累足夠的能量和物質儲備，以應對后續的脅迫處理；其中月桂酸在預培養過程中被布拉氏酵母菌吸收利用，參與細胞膜的構建，使細胞膜脂肪酸組成比例發生變化，使得細胞膜更加穩定，從而提高了酵母菌的應激耐受性。
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1.一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述S1制備布拉氏酵母菌種子液，布拉氏酵母菌按照體積百分比4％～6％添加。
3.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述S1制備布拉氏酵母菌種子液，培養基組成為：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH為6.0。
4.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述步驟S2布拉氏酵母菌種子液按照體積百分比4％～6％接種量接種。
5.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述步驟S3體外脅迫處理，預培養后的布拉氏酵母菌按照體積百分比4％～6％添加，脅迫處理為：人工胃液處理后進行人工腸液處理。
7.根據權利要求5所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述人工腸液組成為：胰蛋白酶10g/L，豬膽鹽3g/L，KH2PO413.6?g/L，pH為6.8；人工腸液培養條件為37℃處理2h。
8.實現權利要求1所述預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下存活率的方法的預培養液，其特征在于，所述預培養液的組成為酵母膏8g/L～12g/L，蛋白胨18g/L～22g/L，葡萄糖18g/L～22g/L，月桂酸18μg/mL～24μg/mL，余量為水，pH為5.8～6.2。
9.根據權利要求8所述預培養液，其特征在于，所述預培養液組成為酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，月桂酸20μg/mL，余量為水，pH為6.0，預培養條件為20℃冷處理24h。
10.根據權利要求8～9任意一項所述預培養液在提高益生菌脅迫條件下存活率中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述s1制備布拉氏酵母菌種子液，布拉氏酵母菌按照體積百分比4％～6％添加。
3.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述s1制備布拉氏酵母菌種子液，培養基組成為：10g/l酵母膏，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，ph為6.0。
4.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述步驟s2布拉氏酵母菌種子液按照體積百分比4％～6％接種量接種。
5.根據權利要求1所述一種預培養聯合冷處理提高布拉氏酵母菌在體外模擬胃腸道脅迫條件下的存活率的方法，其特征在于，所述步驟s3體外脅迫處理，預培養后的布拉氏酵母菌按照體積百分比4％～6％添加，脅迫處理為：人工胃液處理后進行人工腸液處理。
6.根據權利要求5所述一種預培養聯合...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王定康，王友發，王亞楠，彭雯，施琳，張天嘯，孫曉敏，孫孟姊，劉莎，
申請(專利權)人：西安交通大學，
類型：發明
國別省市：
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