【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及循環游離dna檢測煉獄，具體涉及一種脂質體、cfdna提取處理液及其制備方法和應用。
技術介紹
1、循環游離dna(circulating?free?dna，cfdna)是在外周血中發現的游離于細胞外的dna，是核小體凋亡dna在細胞內循環核酸酶的作用下天然斷裂形成的平均長度為180～200bp的小片段。cfdna釋放到血液循環中的機制目前主要有兩種：第一種是通過凋亡或壞死的細胞死亡被動釋放dna。在正常的生理狀態下，由于有吞噬細胞能夠對凋亡和壞死的細胞碎片進行清除，因此健康個體血漿中cfdna含量較低。而在某些特定情況下，如癌癥患者中，這些清除機制不能有效的發揮作用，導致包括dna在內的細胞碎片積累，隨后被一同釋放到血液中。cfdna釋放的第二種機制是通過主動分泌，cfdna的分泌是通過釋放細胞外小泡來進行的。人體cfdna的含量受肥胖、運動及腫瘤等多種因素影響。有研究表明cfdna廣泛存在于人體血液、尿液、腦脊液、胸腹水、卵泡液、唾液等各類體液中。在健康人外周血中cfdna含量均值約為30ng/ml，幾乎都來自凋亡或壞死細胞，腫瘤患者體內的cfdna則更多來源于腫瘤細胞及鄰近非腫瘤細胞的凋亡。
2、目前cfdna的檢測主要有pcr和ngs兩種方法，近年來基于這兩種方法衍生出許多更加高效靈敏的檢測方法。隨著檢測靈敏度和精確度的不斷提高，pcr技術現已發展為實時熒光定量pcr(quantitative?real-time?pcr，qpcr)、數字pcr(digital?pcr，dpcr)和微滴式數字pc
3、cfdna提取效率是決定檢測結果的重要步驟，但cfdna含量低且片段小，如何高效快捷提取cfdna一直是研究的重點。目前提取cfdna主要方法有異戊醇抽提法、磁珠法和親和柱法等，大多實驗室均采用商業試劑盒來提取cfdna。cfdna主要存在于血液中，相比于血清而言，血漿是獲得cfdna更為理想的生物樣本，但其在血液中的總百分比極低且片段小，使得現有市售的cfdna提取試劑盒提取后的核酸濃度太低，很難滿足下游檢測需要。
4、公開號為cn111139234b的中國專利公開了一種游離dna提取試劑盒，用于提取血漿中游離dna，包含脂質體磁珠溶液、洗滌液i、洗滌液ii、洗脫液以及磁分離架。脂質體磁珠溶液含有脂質體磁珠，該脂質體磁珠用于吸附血漿內游離dna并使得dna被分離。該專利技術利用脂質體對磁珠進行處理，增強磁珠特異性性能，有利于吸附血漿內游離dna，但是該專利的游離dna提取效率仍有待提高。因此，需要提供一種提取方法，可以快速高效處理血液樣本，獲得高濃度核酸，以滿足下游檢測的需要。
技術實現思路
1、本專利技術旨在提供一種脂質體及其制備方法，用于制備cfdna提取處理液，提高游離dna的提取效率。
2、本專利技術還提供了一種cfdna提取處理液及其制備方法，cfdna的提取效率高。
3、本專利技術還提供了一種cfdna提取處理液在cfdna提取試劑盒中的應用，提高游離dna的提取效率。
4、為了實現上述目的，本專利技術所采用的技術方案是：
5、一種脂質體，由5～30mm膽固醇和100～600mm磷脂組成；所述磷脂為1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-琥珀酰、1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-琥珀酰的鈉鹽、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的鈉鹽、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸膽堿中的一種或多種。
6、其中，膽固醇可以改善脂質鏈和雙分子層形成的結構，調節膜的流動性和剛性。1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)(鈉鹽)(spe)、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油(鈉鹽)(dspg)和1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸膽堿(dspc)是制備脂質體重要的磷脂，具有較好的穩定性，且雜質含量低。脂質體有較好的柔順性和親水性，可與cfdna競爭被單核-巨噬細胞系統吞噬，從而抑制體外巨噬細胞對cfdna的清除。
7、優選地，1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)和1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)的鈉鹽的濃度為35～200mm，1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油和1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的鈉鹽的濃度為35～200mm，1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸膽堿的濃度為35～200mm。進一步優選地，1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)和1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)的鈉鹽的濃度為150～200mm，1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油和1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的鈉鹽的濃度為150～200mm，1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸膽堿的濃度為150～200mm。
8、根據本專利技術的實施例，還可以對本專利技術作進一步的優化，以下為優化后形成的技術方案：
9、一種脂質體的制備方法，包括以下步驟：
10、將膽固醇、磷脂溶于溶劑，混合反應后，再蒸發溶劑形成脂質膜；
11、脂質膜溶于水或水溶液后，擠壓后制得脂質體。
12、在其中一個優選的實施例中，形成脂質膜的步驟具體為將5～30mm膽固醇溶于氯仿中，加入100～200mm?1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(琥珀酰)(鈉鹽)(spe)、100～200mm?1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油(鈉鹽)(dspg)、100～200mm?1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸膽堿(dspc)中的一種或多種，再與體積比為1:1的甲醇混合，形成混合溶液。
13、形成脂質膜的步驟中將混合溶液在氮氣流下蒸發形成薄的干燥脂質膜，真空去除其附著的有機溶劑。
14、在其中一個優選的實施例中，形成脂質體的步驟中脂質膜在55-65℃下溶于無菌dpbs，水合。
15、在其中一個優選的實施例中，形成脂質體的步驟中擠壓后制得脂質體的過程為在55-65℃下用擠壓機、聚碳酸酯膜擠壓15-25次，得到所需脂質體。具體地，使用avantipolar?lipids公司生產的800-1200μl迷你擠壓機將merck公司生產的0.3-0.5μm聚碳酸酯膜擠壓15-25次，得到所需脂質體。
16、本專利技術還公開了一種cfdna提取處理液，包括脂質體，還包括50～75mm?tris-hcl、5～25m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種脂質體，其特征在于，由5～30mM膽固醇和100～600mM磷脂組成；所述磷脂為1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-琥珀酰、1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-琥珀酰的鈉鹽、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰磷脂酰甘油的鈉鹽、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸膽堿中的一種或多種。
2.一種脂質體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.一種cfDNA提取處理液，其特征在于，包括權利要求1中的脂質體，還包括50～75mMTris-HCl、5～25mM?EDTA、10～20mM?DTAP、0.05～0.1％ProClin?300；優選地，所述cfDNA提取處理液還包括50～60mM?Tris-HCl、10～15mM?EDTA、15～20mM?DTAP、0.05～0.08％ProClin?300。
4.一種權利要求3所述的cfDNA提取處理液在cfDNA提取試劑盒中的應用，其特征在于，在抗凝全血樣本中加入權利要求3中的cfDNA提取處理液，培養、分離得到血漿后，再檢測cfDNA。
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