一種檢測核酸點突變的方法技術

本發明專利技術提供了一種檢測核酸點突變的方法。具體地，本發明專利技術方法包括與待檢測核酸樣品與本發明專利技術的探針進行雜交，并檢測是否形成“待檢測核酸－探針”雜交復合物，其中在本發明專利技術的探針序列中額外引入一個人工的不匹配位點，從而在探針結合區與待檢測的含點突變的序列之間可出現了兩個不匹配位點。使用本發明專利技術的探針時，可以在反向雜交檢測核酸點突變中，使得探針針對野生型和突變型得檢測信號產生明顯的區別，從而可以更明確地判定檢測結果。試驗表明，本發明專利技術可有效提高檢測信噪比從而提高檢測靈敏度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及核酸診斷
，具體地涉及。更具體地，涉及一種利用寡核苷酸探針對PCR產物進行反向雜交以檢測核酸點突變的方法，采用本專利技術方法可以有效提高檢測信噪比從而提高檢測靈敏度。
技術介紹
反向雜交是進行核酸檢測的重要技術方法，廣泛用于可進行高通量檢測的芯片類技術。 反向雜交的基本原理是首先將寡核苷酸探針共價交鏈在一定的固相載體表面，如膜條、微球(如不同熒光微球)等；然后將PCR擴增產物和寡核苷酸混和，在一定的雜交體系中，寡核苷酸探針和目標序列按照堿基互補的原則發生特異性的識別和結合；最后經過一定的酶促或熒光等信號放大過程，最終獲得檢測信號并依次判定被檢測的目標產物是否存在及濃度高低。 反向雜交技術應用于點突變檢測時遇到的一個最大的難題就是寡核苷酸探針針對突變型和野生型目標序列檢測的信號比較接近，因此無法明確或有效地判定檢測結果。 因此，本領域迫切需要開發能夠更明確地判定核酸點突變的檢測方法。
技術實現思路
本專利技術的目的就是提供一種更明確地判定核酸點突變的檢測方法。 具體地，本專利技術提供了一種新的寡核苷酸探針的序列設計方法，使得在反向雜交檢測核酸點突變時，探針針對野生型和突變型得檢測信號產生明顯得區別，從而可以明確判定檢測結果。 在本專利技術的第一方面，提供了一種用于檢測核酸點突變的探針，所述探針的結構如式I所示 Z-L-B(式I) 式中， B表示探針與靶核酸結合的核酸結合區； Z表示可有可無的固相載體； L是連接臂；當Z不存在時，L是用于將B連接于Z的連接臂；當Z存在時，L是已經將B與Z相連的連接臂； 并且，所述的探針與靶核酸結合的結合區B具有式II所示的5’-3’結構 S1-P1-S2-P2-S3(式II) 式中， P1和P2分別是一個堿基，其中的一個是針對突變位點的堿基，該堿基與野生型序列互補但與突變型序列不互補，或者該堿基與野生型序列不互補但與突變型序列互補；而另一個是輔助性的不匹配堿基，該堿基既與野生型序列不互補，也與突變型序列不互補； S1是與野生型序列和突變型序列互補的結合區5’端核苷酸序列，其長度為X1個堿基； S2是與野生型序列和突變型序列互補的結合區中部核苷酸序列，其長度為X2個堿基； S3是與野生型序列和突變型序列互補的結合區3’端核苷酸序列，其長度為X3個堿基； 其中，X1、X2和X3的長度差的絕對值同時滿足以下條件 |X1-X2|≤4； |X3-X2|≤4； |X1-X3|≤4； 并且|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤8。 在另一優選例中，|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤6，更佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤4，最佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|＝0。 在另一優選例中，X1、X2和X3的長度差的絕對值同時滿足以下條件 |X1-X2|≤3； |X3-X2|≤3； |X1-X3|≤3。 在另一優選例中，X1、X2和X3的長度差的絕對值同時滿足以下條件 |X1-X2|≤2； |X3-X2|≤2； |X1-X3|≤2。 在另一優選例中，所述的探針與靶核酸結合的結合區B的長度為15-25個堿基，更佳地為16-22個堿基。 在另一優選例中，所述的連接臂的長度為8-30個堿基。 在另一優選例中，連接臂為10～20聚體的polyT。 在另一優選例中，所述的固相載體是熒光編碼微球、膜條或玻片。 在另一優選例中，所述的探針的結合區序列如SEQ ID NO7-13所示。 在本專利技術的第二方面，提供了一種檢測核酸樣品是否存在點突變的檢測方法，包括步驟 將本專利技術第一方面中所述的探針與待檢測核酸樣品進行雜交，并檢測是否形成“待檢測核酸-探針”雜交復合物，其中未形成所述的雜交復合物就表示樣品存在所述的點突變，而形成所述的雜交復合物就表示樣品存在所述的點突變。 在另一優選例中，該方法還包括將檢測結果與陽性對照和陰性對照進行比較。 在另一優選例中，將檢測信號值與陰性對照(野生型)的信號值進行比較，并在檢測信號值與陰性對照信號值的比值大于1.5(較佳地≥2.0，更佳地≥2.5，最佳地≥3.0)時，判定樣品存在所述的點突變。 在本專利技術的第三方面，提供了一種用于核酸點突變的試劑盒，包括容器以及位于容器中的本專利技術第一方面中所述的探針。 應理解，在本專利技術范圍內，本申請上述以及下述的各技術特征可以各種方式進行組合，以構成各種優選例。例如，探針與靶核酸結合的結合區B的長度為15-25個堿基，更佳地為16-22個堿基，其中一般范圍的下限15個堿基可以與優選范圍的上限22個堿基進行組合，從而構成范圍15-22個堿基；反之亦然。 附圖說明 圖1A和1B顯示了現有技術中探針與突變型模板以及與野生型模板的結合示意圖。 圖2A顯示了本專利技術一個實例中探針的結構示意圖。 圖2B顯示了本專利技術一個實例中，探針共價交聯于固相載體上的示意圖。 圖3A和3B顯示了本專利技術一個實例中探針與突變型模板以及與野生型模板的結合示意圖。 具體實施例方式 本專利技術人經過廣泛而深入的研究，意外地發現，通過在探針序列中額外引入一個人工的不匹配位點，在探針結合區與待檢測的含點突變的序列之間就可出現了兩個不匹配位點(原點突變位點+人工引入的不匹配位點)，從而可以使得在反向雜交檢測核酸點突變時，探針針對野生型和突變型得檢測信號產生明顯的區別，從而可以更明確地判定檢測結果。在此基礎上完成了本專利技術。 簡而言之，本專利技術是利用額外引入一個人工的不匹配位點，從而使得探針針對野生型和突變型得檢測信號產生明顯的區別，進而更明確地判定點突變。 為了便于理解本專利技術，本專利技術人提供了以下基本原理。然而，應理解，本專利技術的保護范圍并不受限于本專利技術的基本原理。 參見圖1-3。 傳統的方法是將突變位點設計在探針結合區的中間位置，如圖1所示。圖1A顯示的是探針結合區同突變型雜交，探針結合區和模板之間堿基序列完全匹配形成雜交體；圖1B顯示探針結合區和野生型模板的雜交情況，探針結合區和野生型模板之間有一個堿基不匹配，雖然存在一個堿基的不匹配情況，但探針和野生型模板之間仍然可以形成較穩定的雙鏈雜交體，這是造成探針無法區分突變型和野生型的主要原因之一。 在本專利技術中，針對核酸點突變的寡核苷酸探針的設計如下寡核苷酸探針包括兩個部分如圖2A所示探針右邊部分(直線所示)為結合區，長度宜為16～22個堿基長度，結合區同檢測位點的模板序列互補，用于檢測突變序列是否存在。左邊部分(波浪線所示)為可有可無的連接臂。當寡核苷酸探針需要與固相載體相連時，通常需要連接臂。 連接臂的長度通常為8-30個堿基(較佳地10～20個堿基)，一般為同聚寡核苷酸(如T)，如連續的10～20個T堿基。連接臂的左端有用于和固相載體共價交鏈的活性基團，通常是氨基，連接臂的作用是將探針結合區同固相載體間隔開以利于探針和檢測模板的充分結合。 在本專利技術中，可適用的固相載體沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)熒光編碼微球、膜條或玻片等。 在本專利技術中，在探針結合區引入一個人工設計的不匹配堿基序列，這樣探針結合區同野生型模板序列之間就出現了兩個不匹配位點，一個是人工設計本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測核酸點突變的探針，其特征在于，所述探針的結構如式Ⅰ所示：　　Ｚ－Ｌ－Ｂ　（式Ⅰ）　　式中，　　Ｂ表示探針與靶核酸結合的核酸結合區；　　Ｚ表示可有可無的固相載體；　　Ｌ是連接臂；當Ｚ不存在時，Ｌ是用于將Ｂ連接于Ｚ的連接臂；當Ｚ存在時，Ｌ是已經將Ｂ與Ｚ相連的連接臂；　　并且，所述的探針與靶核酸結合的結合區Ｂ具有式Ⅱ所示的５’－３’結構：　　Ｓ１－Ｐ１－Ｓ２－Ｐ２－Ｓ３　（式Ⅱ）　　式中，　　Ｐ１和Ｐ２分別是一個堿基，其中的一個是針對突變位點的堿基，該堿基與野生型序列互補但與突變型序列不互補，或者該堿基與野生型序列不互補但與突變型序列互補；而另一個是輔助性的不匹配堿基，該堿基既與野生型序列不互補，也與突變型序列不互補；　　Ｓ１是與野生型序列和突變型序列互補的結合區５’端核苷酸序列，其長度為Ｘ１個堿基；Ｓ２是與野生型序列和突變型序列互補的結合區中部核苷酸序列，其長度為Ｘ２個堿基；　　Ｓ３是與野生型序列和突變型序列互補的結合區３’端核苷酸序列，其長度為Ｘ３個堿基；　　其中，Ｘ１、Ｘ２和Ｘ３的長度差的絕對值同時滿足以下條件：　　｜Ｘ１－Ｘ２｜≤４；　　｜Ｘ３－Ｘ２｜≤４；　　｜Ｘ１－Ｘ３｜≤４；　　并且｜Ｘ１－Ｘ２｜＋｜Ｘ３－Ｘ２｜＋｜Ｘ１－Ｘ３｜≤８。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：姚見兒，白艷軍，談暢，李久彤，
申請(專利權)人：上海透景生命科技有限公司，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]