【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種生物標記磁珠的加工方法及其檢測偶聯效率的方法。
技術介紹
1、磁珠是醫學、分子生物學、免疫學等研究中的重要載體工具。例如，羧基磁珠具有超順磁性、快速磁響應性、高羧基含量、單分散性和亞微米尺度粒徑等特點，羧基磁珠表面生物分子的修飾是利用edc縮合的方法，生物活性分子(多肽、蛋白、寡聚核苷酸等)可與磁珠表面的官能基團結合，廣泛應用于分離、檢測和臨床診斷等領域中，因為其簡便的操作和穩定的結果，得到越來越廣泛的應用。
2、當利用磁珠偶聯蛋白時，蛋白偶聯效率是一個重要的評價指標，偶聯效率的高低直接影響到后續實驗的準確性和可靠性，若磁珠的蛋白偶聯效率過低，則需要對偶聯反應的條件進行優化。在利用羧基磁珠進行核酸適配體篩選時，磁珠蛋白偶聯量直接影響后續核酸適配體篩選的效果。因此，如何簡單、快速地對磁珠表面蛋白偶聯效率和偶聯量進行相對準確的定量測定，具有十分重要的研究意義。
3、專利cn202110579153.6公開了一種磁珠蛋白偶聯效率的檢測方法，具體是：將活化后的磁珠與蛋白進行偶聯反應，得到偶聯蛋白的磁珠，然后對所述偶聯蛋白的磁珠表面未反應的結合位點進行熒光標記，得到待測樣品；對活化后的磁珠表面的全部結合位點進行熒光標記，得到陽性對照品；以磁珠、活化后的磁珠或者偶聯蛋白的磁珠作為空白對照品；測定待測樣品、陽性對照品、空白對照品的熒光值，計算磁珠的蛋白偶聯效率。該專利檢測方法存在以下缺點：
4、1.偶聯的蛋白表面存在大量的氨基，所以氨基活性基團的熒光染料無法實現定向偶聯磁珠表
5、2.利用蛋白上的his標簽結合熒光染料時，每個蛋白his標簽暴露的情況不同，會導致結果產生一定的誤差；而且這種方法只能定性，不能進行定量。
技術實現思路
1、為了克服上述現有技術所述的至少一個缺陷，本專利技術的目的之一是提供一種生物標記磁珠的加工方法，其可解決現有技術中測試偶聯蛋白的磁珠的偶聯效率的檢測結果不準確的問題；
2、本專利技術的目的之二是提供一種檢測偶聯效率的方法，其可解決利用蛋白上的his標簽結合熒光染料時，每個蛋白his標簽暴露的情況不同，會導致結果產生一定的誤差，而且現有技術只能定性，不能進行定量的問題。
3、本專利技術為解決其問題所采用的技術方案是：
4、一種生物標記磁珠的加工方法，應用于偶聯效率檢測，包括如下步驟：
5、s1、取若干磁珠，并將磁珠活化；
6、s2、對活化后的磁珠與蛋白偶聯，獲得偶聯蛋白的磁珠；
7、s3、對偶聯蛋白的磁珠表面未結合的位點使用生物素標記的分子進行標記，獲得生物素標記的偶聯蛋白的磁珠。
8、通過采用上述方案，通過在s3步驟中對偶聯蛋白磁珠表面未結合位點進行生物素標記，能夠特異性地識別并標記剩余未偶聯的位點，從而通過對比標記前后發光值的差異，精確計算偶聯效率，提高了檢測的敏感性和準確性。在后續的檢測偶聯效率實驗中，結合發光檢測技術，實現偶聯效率的直接量化評估，而非僅僅定性觀察，極大地提高了評估結果的精確性和客觀性。
9、并且，通過在s3步驟中對偶聯蛋白磁珠表面未結合位點進行生物素標記，還可以準確反映出偶聯反應的飽和度，幫助科研人員快速識別最佳偶聯條件，如蛋白濃度、偶聯時間和溫度，優化偶聯工藝，提升實驗成功率。
10、另外，通過整合生物素標記與發光檢測技術，簡化了傳統的偶聯效率檢測流程，減少了一些繁瑣的中間步驟，降低了實驗成本，同時縮短了實驗周期，提高了實驗室的工作效率。
11、進一步地，所述磁珠的粒徑為0.1-30μm。
12、通過采用上述方案，通過設定磁珠的粒徑為0.1-30μm，此尺寸優化了磁珠的表面積與體積比，既能保證足夠的生物分子偶聯位點，又易于與目標分子有效接觸，提高了偶聯效率與反應速度，同時減少了因粒徑過大可能導致的傳質限制或過小引起的物理穩定性問題。并且特定粒徑的磁珠在流動或固定化過程中能更有效地減少非特異性吸附，確保實驗結果的準確性和重復性，這對于需要高度純凈度和特異性的生物分子分離、檢測實驗非常重要。另外0.1-30μm的磁珠粒徑適合自動化處理設備，如流式細胞儀、自動化工作站等，便于進行高通量篩選和分析，提高了實驗的效率和處理能力。
13、進一步地，所述磁珠為羧基磁珠、氨基磁珠、巰基磁珠、生物素磁珠、硅羥基磁珠和磁性多糖基磁珠中的一種。
14、通過采用上述方案，提供了多種選擇，拓展了應用范圍，滿足不同分子偶聯需求，提高了技術的靈活性。
15、進一步地，所述磁珠為羧基磁珠，所述羧基磁珠的活化的具體步驟如下：
16、a1、將羧基磁珠放入naoh清洗，并用ddh2o清洗兩次后，磁分離去除上層液體；
17、a2、加入羧基活化劑，在室溫環境下，讓磁珠與羧基活化劑充分振蕩混勻并接觸20至30分鐘，磁分離棄上清；
18、a3、用超純水快速清洗，以去除多余的羧基活化劑，再進行磁分離去上清液。
19、通過采用上述方案，通過使用naoh清洗去除表面雜質，確保了活化過程的純凈起點，加入羧基活化劑在特定條件下充分作用，增強了磁珠表面的反應活性，確保了高效且穩定的偶聯反應基礎。
20、并且通過多次清洗流程，有效減少了非特異性結合的風險，使得后續的生物標記和檢測步驟更為準確，提高了數據的信噪比，對復雜生物樣本的分析尤為有利。
21、進一步地，所述羧基活化劑為n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)的混合溶液，所述羧基活化劑由濃度為0.1mo?l/l的nhs和濃度為0.4mo?l/l的edc溶液按體積比1：1混合而成，所述羧基磁珠質量與羧基活化劑體積之比為1μg：1μl。
22、通過采用上述方案，使用濃度為0.1mo?l/l的nhs和0.4mo?l/l的edc按1:1體積比混合的活化劑方案，既考慮了nhs作為活化劑的效率，也兼顧了edc作為交聯劑的功能，為偶聯反應提供了最佳的化學環境，促進穩定且高效的共價偶聯。該比例和活化條件的設定，確保了磁珠表面的每個羧基都能盡可能多地與蛋白或其他生物分子的氨基形成共價鍵，減少了未偶聯位點，提高了偶聯產物的穩定性和整體偶聯效率，為后續的生物標記和檢測提供更可靠的基底。
23、本專利技術還提供一種檢測偶聯效率的方法，包括如下步驟：
24、b1、將若干磁珠活化，并將活化后的磁珠分為四等份，分別為待測樣品組、陽性對照品組、待測樣品空白對照組和陽性空白對照組；
25、b2、所述待測樣品組將活化后的磁珠與蛋白偶聯，得到偶聯蛋白的磁珠，后對本步驟中的偶聯蛋白的磁珠表面未結合的位點利用生物素標記的分子進行標記；
26、b3、所述陽性對照品組將活化后的磁珠表面的全部結合位點使用生物素標記的分子標記；
27、b4、所述待測樣品空白對照組將活化后本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種生物標記磁珠的加工方法，應用于偶聯效率檢測，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠的粒徑為0.1-30μm。
3.根據權利要求1所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠為羧基磁珠、氨基磁珠、巰基磁珠、生物素磁珠、硅羥基磁珠和磁性多糖基磁珠中的一種。
4.根據權利要求1或2所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠為羧基磁珠，所述羧基磁珠的活化的具體步驟如下：
5.根據權利要求4所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述羧基活化劑為N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液，所述羧基活化劑由濃度為0.1mol/L的NHS和濃度為0.4mol/L的EDC溶液按體積比1：1混合而成，所述羧基磁珠質量與羧基活化劑體積之比為1μg：1μL。
6.一種檢測偶聯效率的方法，其特征在于，包括如下步驟：
7.根據權利要求6所述的一種檢測偶聯效率的方法，其特征在于，所述B
8.根據權利要求6所述的一種檢測偶聯效率的方法，其特征在于，所述生物素標記的分子為BSA和BSA-Biotin的混合溶液。
9.根據權利要求6所述的一種檢測偶聯效率的方法，其特征在于，所述B1、B2和B3步驟中的磁珠為羧基磁珠，其標記方法為：將活化后的羧基磁珠或者偶聯蛋白的羧基磁珠加入BSA和BSA-Biotin的混合溶液中，在室溫下振蕩孵育1-3h進行標記，然后磁分離棄上清，清洗，再磁分離棄上清。
10.根據權利要求6所述的一種檢測偶聯效率的方法，其特征在于，所述B2-B5步驟中的磁珠為羧基磁珠，用鏈霉親和素和堿性磷酸酶的融合蛋白(SA-AP)識別磁珠上的Biotin，再通過檢測AP催化發光底物反應的發光值，實現Biotin的定量。
...【技術特征摘要】
1.一種生物標記磁珠的加工方法，應用于偶聯效率檢測，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠的粒徑為0.1-30μm。
3.根據權利要求1所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠為羧基磁珠、氨基磁珠、巰基磁珠、生物素磁珠、硅羥基磁珠和磁性多糖基磁珠中的一種。
4.根據權利要求1或2所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述磁珠為羧基磁珠，所述羧基磁珠的活化的具體步驟如下：
5.根據權利要求4所述的一種生物標記磁珠的加工方法，其特征在于：所述羧基活化劑為n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)的混合溶液，所述羧基活化劑由濃度為0.1mol/l的nhs和濃度為0.4mol/l的edc溶液按體積比1：1混合而成，所述羧基磁珠質量與羧基活化劑體積之比為1μg：1μl。
6.一種檢測偶聯效率的方法，其特征在于，包括如下步驟：
7.根據...
【專利技術屬性】
技術研發人員：羅昭鋒，吳金夢，徐晶，汪鈴泓，馮夢楚，郭晗，張崢，刁寒，呂少康，高毓婉，
申請(專利權)人：中國科學院杭州醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。