本發明專利技術公開了一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，屬于生物工程技術領域。本發明專利技術提供了一種新的砷土壤修復技術：通過對谷氨酸棒狀桿菌14067進行基因工程改造，構建一種高效修復甲基亞砷酸鹽[MAs(Ⅲ)]污染的土壤的菌株。本發明專利技術的目的在于提供一種新的修復砷污染的重組菌株。該菌株可應用范圍廣，可應用性強且高效，環保，成本低；通過構建出可固定有機砷和甲基亞砷酸鹽[MAs(Ⅲ)]的菌株對砷污染土壤進行修復。相較于目前已知的研究方法，本發明專利技術的方法簡單，綠色環保，可應用范圍廣便于推廣應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程，具體涉及一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法。
技術介紹
1、砷是一種劇毒的類金屬元素，在自然環境中無機砷會轉化成五價有機砷，三價有機砷，芳香族和甲基砷。五價有機砷相對溫和，毒性低于無機砷；然而，芳香族和甲基砷在環境中降解為毒性更強的無機形式，會造成食物和水資源污染，嚴重威脅生物群和人類健康。與有機污染物不同的是金屬和類金屬元素不能被破壞，但它們可以被固定或轉化為毒性較小的形式。
2、目前,常用的甲基亞砷酸鹽污染修復技術主要有吸附法、混凝沉淀法、氧化法、離子交換法、膜分離法、植物法等。由于傳統的物化處理方法存在著能耗高、產生二次污染的特點,微生物法去除甲基亞砷酸鹽因其高效、環保且成本低等優勢而具有較大的應用前景。
3、有鑒于此，非常有必要開發一種用于高效去除甲基亞砷酸鹽的微生物，助力砷污染的修復。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的問題，本專利技術提供了一種新的砷污染土壤修復技術：通過對谷氨酸棒狀桿菌14067進行基因工程改造，構建一種高效修復甲基亞砷酸鹽[mas(ⅲ)]污染的土壤的菌株。本專利技術的目的在于提供一種新的修復砷污染的重組菌株。該菌株可應用范圍廣，可應用性強且高效，環保，成本低；通過構建出可固定甲基亞砷酸鹽[mas(ⅲ)]的菌株對砷污染土壤進行修復。相較于目前已知的研究方法，本專利技術的方法簡單，綠色環保，可應用范圍廣便于推廣應用。
2、為實現以上目的，本專利技術提供的技術方案如下：
3、本專利技術提供一種高效去除甲基亞砷酸鹽污染土壤的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，其包括以下步驟：
4、步驟s1：根據ncbi數據庫genbank:kf899847.1構建包含對甲基亞砷酸鹽敏感的操縱子arsr和甲基亞砷酸鹽的裂解基因arsi序列并擴增此序列；
5、步驟s2：優化過后的基因序列與pxmj19進行重組，構建cmas質粒；
6、步驟s3：將得到的質粒通過電轉轉化進入谷氨酸棒狀桿菌構建而成。
7、步驟s1中，所述甲基亞砷酸鹽敏感的操縱子arsr及甲基亞砷酸鹽的裂解基因序列arsi如seq?id?no：1所示。
8、步驟s1中，所述擴增序列的pcr引物如下：
9、目的基因片段擴增引物
10、
引物名稱
sequence(5’-3’)
ars-f
agcccttgccgataagataagg
ars-r
ctcggcttgcaactttttcga
11、陽性轉化子驗證引物
12、
引物名稱
sequence(5’-3’)
cmas-f
aagtttaaagcccttgccga
cmas-r
aggttggtggatgtgtgctg
13、步驟s2中，所述構建cmas質粒，進一步包括如下步驟：
14、第一步：引物設計
15、其中表1目的基因片段擴增引物
16、
引物名稱
sequence(5’-3’)
ars-f
agcccttgccgataagataagg
ars-r
ctcggcttgcaactttttcga
17、第二步：目的蛋白基因片段擴增
18、使用諾唯贊2×taq?master?mix(dye?plus)(p111)進行pcr擴增目的基因片段。優選地，所述pcr擴增體系：
19、
模板dna
1ul
引物f/r
各2ul
2×taqmastermix
25ul
水
20ul
總體系
50ul
20、bio-rad?pcr擴增程序：
21、
22、第三步：對pxmj19空質粒載體進行雙酶切(hindⅲ和bamhⅰ)
23、優選地，所述酶切體系：
24、
25、優選地，所述酶切反應條件：37℃水浴酶切30min，1％瓊脂糖凝膠驗證質粒載體是否完全酶切，利用膠回收試劑盒對酶切完全的質粒進行純化回收。
26、第四步：片段與質粒連接
27、將酶切質粒與目的基因片段混合，利用諾唯贊clonexpress?multis?one?stepcloning?kit(c113-01)無縫克隆試劑盒進行連接，并將連接產物轉入大腸桿菌感受態dh5α(維地生物dl1001)中。
28、優選地，所述酶切質粒與目的基因片段體積比為1：3。
29、優選地，所述連接體系與反應條件：
30、
31、第五步：陽性轉化子的菌落pcr驗證
32、其中，所述陽性轉化子的菌落pcr驗證引物為目的基因擴增引物，pcr程序相同。
33、第六步：cmas重組質粒提取
34、本文檔來自技高網
...
【技術保護點】
1.一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.權利要求1中所述的一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，其特征在于，步驟S1中，所述甲基亞砷酸鹽敏感的操縱子ArsR及甲基亞砷酸鹽的裂解基因序列ArsI如SEQ?ID?NO：1所示。
3.權利要求1中所述的一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，其特征在于，步驟S1中，所述擴增序列的PCR引物如下：
4.權利要求1中所述的一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，其特征在于，步驟S2中，所述構建CMAs質粒，進一步包括如下步驟：
5.權利要求1中的方法構建的菌株。
6.權利要求5的菌株在去除甲基亞砷酸鹽中的應用。
【技術特征摘要】
1.一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.權利要求1中所述的一種高效去除甲基亞砷酸鹽的谷氨酸棒狀桿菌菌株構建方法，其特征在于，步驟s1中，所述甲基亞砷酸鹽敏感的操縱子arsr及甲基亞砷酸鹽的裂解基因序列arsi如seq?id?no：1所示。
3.權利要求1中所述的一種高效去除甲基亞砷...
【專利技術屬性】
技術研發人員：喬靜，陳心如，吳佳雯，
申請(專利權)人：安徽醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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