【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及均相發(fā)光，特別涉及均相發(fā)光檢測(cè)抗原標(biāo)記方法及試劑盒。
技術(shù)介紹
1、光激化學(xué)發(fā)光（light?initiated?chemiluminescent?assay，lica）也稱為均相發(fā)光，是一種新型化學(xué)發(fā)光分析方法，已逐漸被臨床實(shí)驗(yàn)室接受并得到一定程度的應(yīng)用。此項(xiàng)技術(shù)不同于傳統(tǒng)酶促化學(xué)發(fā)光，均相發(fā)光省去了分離和洗滌的步驟，縮短反應(yīng)時(shí)序，精密度高，檢測(cè)速度快，完美實(shí)現(xiàn)均相免疫分析。均相發(fā)光的檢測(cè)分為兩個(gè)階段：抗原-抗體結(jié)合和化學(xué)發(fā)光過(guò)程。以雙抗體夾心檢測(cè)抗原為例說(shuō)明：首先，一對(duì)特異性抗體分別標(biāo)記生物素（bio-ab）和包被發(fā)光微球（fg-ab），分別為r1和r2；感光微球溶液（通用溶液）包被鏈霉親和素（gg-sa），為r3。其次，于96微孔板內(nèi)分別加入r1+r2，以及待檢樣本或校準(zhǔn)品，啟動(dòng)第一階段溫浴后，于發(fā)光微球表面形成雙抗體夾心復(fù)合物（fg-ab-ag-ab-bio）；無(wú)需洗滌再加入通用溶液（gg-sa）r3，啟動(dòng)第二階段溫浴，fg微球通過(guò)表面生物素結(jié)合gg微球表面的鏈霉親和素，兩種微球相互靠近；此時(shí)，用激光束激發(fā)，誘導(dǎo)上述化學(xué)發(fā)光過(guò)程產(chǎn)生光信號(hào)。
2、在發(fā)光微球標(biāo)記過(guò)程中，分子量相對(duì)較小的抗原，如果按照抗體進(jìn)行標(biāo)記的話，在原材料篩選過(guò)程中，易出現(xiàn)沒(méi)有信號(hào)梯度、非特異性較強(qiáng)、高值端出現(xiàn)hook現(xiàn)象、陰陽(yáng)性難以區(qū)分、對(duì)原料損耗大、錯(cuò)過(guò)最優(yōu)原料配對(duì)等現(xiàn)象。
3、谷氨酸脫羧酶抗體（gad-ab）作為與谷氨酸脫羧酶特異性結(jié)合的免疫性物質(zhì)，能夠?qū)μ悄虿〉姆诸愡M(jìn)行診斷，谷氨酸脫羧酶（gad）通過(guò)催化谷氨
4、動(dòng)物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶分為兩種亞型：gad65和gad67，兩者都以二聚體的形式存在，但具有不同的結(jié)構(gòu)特征，序列同序性只有60%。在動(dòng)物體內(nèi)gad67和gad65都負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化gaba，而gad67始終處于活性狀態(tài)來(lái)保持機(jī)體內(nèi)l-glu/gaba的正常代謝；gad65通常以脫輔酶的形式存在細(xì)胞中，僅在機(jī)體迫切需要gaba時(shí)才具有活性，通過(guò)破壞胰島β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而引起胰島素自身分泌障礙，是胰島素依賴癥糖尿病人（i型糖尿病）血清中自身抗體的靶抗原。這種先天性的缺乏，i型糖尿病患者需要終身依賴胰島素進(jìn)行治療。
5、谷氨酸脫羧酶抗體對(duì)糖尿病人群的診斷除了針對(duì)i型糖尿病患者外，對(duì)成人隱匿性自身免疫性糖尿病（lada）也具有一定的診斷意義，lada是一種臨床早期不依賴胰島素治療，以胰島β細(xì)胞遭受緩慢的自身免疫損害為特征的糖尿病類型，更趨向于ii型糖尿病。一般針對(duì)發(fā)病年齡≥18歲的人群，lada患者胰島自身抗體呈陽(yáng)性，單一抗體診斷l(xiāng)ada敏感性為：gad-a>ia2>iaa；診斷糖尿病后至少半年不依賴胰島素治療。
6、目前，臨床上用于檢測(cè)gad-ab的試劑主要采用酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）、放射結(jié)合法（rba）／放射配體法（rla）和間接免疫熒光法（ifa），但這些方法都存在著一些不足之處。酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）的基本原理是將抗原結(jié)合到固相載體表面，通過(guò)酶標(biāo)記抗原，然后加入待測(cè)抗體與抗原結(jié)合形成復(fù)合物，最后通過(guò)顯色反應(yīng)對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)。由于特異性好、操作簡(jiǎn)便且無(wú)放射性污染，因此elisa法常被用于臨床胰島自身抗體的檢測(cè)。但傳統(tǒng)elisa法的靈敏度較低，這可能與抗原包被平板導(dǎo)致其表面決定簇的空間構(gòu)象不能充分暴露有關(guān)。放射結(jié)合法（rba）／放射配體法（rla）是目前檢測(cè)gad-ab和ia-2a的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化方法。在rba法中，gad65／ia-2抗原由編碼gad65／ia-2的質(zhì)粒與tnt偶聯(lián)網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄-翻譯合成。合成的胰島自身抗原，經(jīng)35s蛋氨酸標(biāo)記后，與待測(cè)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)儀完成放射性同位素標(biāo)記抗原-抗體的測(cè)定。在rba法中，抗原的生物活性和空間構(gòu)象得到最大程度的保留，因此rba法具有較高的靈敏度和特異性。但由于操作復(fù)雜、技術(shù)要求高等因，rba法在國(guó)內(nèi)無(wú)法得到推廣及應(yīng)用。間接免疫熒光法（ifa）的原理是采用人胰腺冰凍切片作為抗原底物，在特異性抗體與抗原反應(yīng)形成復(fù)合物后，利用熒光素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合抗原－抗體復(fù)合物，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)未知抗體。目前ifa法主要用于ica的檢測(cè)，盡管ifa法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，但會(huì)受到包括非特異性熒光在內(nèi)的多種干擾因素影響，并且其診斷的靈敏度和特異性仍待提高。cn107102140a公開(kāi)了一種檢測(cè)谷氨酸脫羧酶抗體直接化學(xué)發(fā)光試劑盒及其使用方法，該試劑盒通過(guò)檢測(cè)25?μl樣本量，所需樣本量較大，采用雙抗原夾心法檢測(cè)被測(cè)樣品中谷氨酸脫羧酶抗體含量。因此，開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)所需樣品少、檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高的檢測(cè)試劑盒十分必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)提供了均相發(fā)光檢測(cè)抗原標(biāo)記方法及試劑盒，基于該抗原標(biāo)記方法制得的均相發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒可省去洗滌步驟，檢測(cè)時(shí)間短、所需樣品少、靈敏度高、特異性好、線性范圍與可報(bào)告范圍寬。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了用于均相發(fā)光的抗原標(biāo)記方法，包括在標(biāo)記物上標(biāo)記抗原的步驟，其中，抗原標(biāo)記濃度根據(jù)抗原標(biāo)記摩爾濃度比等于已知抗體標(biāo)記摩爾濃度比的關(guān)系來(lái)確定。
4、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述抗原標(biāo)記方法所述抗原標(biāo)記濃度根據(jù)式i確定，所述式i為：
5、。
6、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述抗原標(biāo)記方法所述抗原標(biāo)記濃度通過(guò)驗(yàn)證優(yōu)選出最優(yōu)抗原標(biāo)記濃度確定。
7、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述抗原標(biāo)記方法所述驗(yàn)證包括依據(jù)所述抗原標(biāo)記濃度，設(shè)置不同濃度梯度制備不同試劑盒，基于所述試劑盒的最優(yōu)檢測(cè)結(jié)果確定最優(yōu)抗原標(biāo)記濃度，完成驗(yàn)證。
8、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述抗原標(biāo)記方法包括以下步驟：
9、步驟1：根據(jù)所述式i確定抗原標(biāo)記濃度；
10、步驟2：根據(jù)所述抗原標(biāo)記濃度設(shè)置候選抗原標(biāo)記濃度；
11、步驟3：根據(jù)所述候選抗原標(biāo)記濃度在標(biāo)記物上標(biāo)記抗原，獲得檢測(cè)試劑；
12、步驟4：根據(jù)所述檢測(cè)試劑檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，獲得反應(yīng)曲線和/或決定系數(shù)（r2）；
13、步驟5：根據(jù)所述反應(yīng)曲線和/或所述決定系數(shù)確定最優(yōu)抗原標(biāo)記濃度；
14、步驟6：根據(jù)所述最優(yōu)抗原標(biāo)記濃度在標(biāo)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.用于均相發(fā)光的抗原標(biāo)記方法，包括在標(biāo)記物上標(biāo)記抗原的步驟，其特征在于，根據(jù)抗原標(biāo)記摩爾濃度比等于已知抗體標(biāo)記摩爾濃度比的關(guān)系來(lái)確定抗原標(biāo)記濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的抗原標(biāo)記方法，其特征在于，所述抗原標(biāo)記濃度根據(jù)式I確定，所述式I為：
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗原標(biāo)記方法，其特征在于，所述標(biāo)記物包括發(fā)光微球或生物素。
4.均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括在標(biāo)記物上標(biāo)記的抗原，其特征在于，所述抗原在標(biāo)記物上的標(biāo)記方法為權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗原標(biāo)記方法。
5.如權(quán)利要求4所述的均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗原包括谷氨酸脫羧酶。
6.如權(quán)利要求4或5所述的均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記物包括發(fā)光微球和/或生物素。
7.如權(quán)利要求6所述的均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括生物素試劑工作液、發(fā)光試劑工作液和感光試劑工作液。
8.如權(quán)利要求7所述的均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述生物素試劑工作液包括生物素-抗原母液；
9.如權(quán)利要求8所述的均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在
10.如權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述生物素試劑工作液還包括生物素試劑基礎(chǔ)緩沖液；
...【技術(shù)特征摘要】
1.用于均相發(fā)光的抗原標(biāo)記方法，包括在標(biāo)記物上標(biāo)記抗原的步驟，其特征在于，根據(jù)抗原標(biāo)記摩爾濃度比等于已知抗體標(biāo)記摩爾濃度比的關(guān)系來(lái)確定抗原標(biāo)記濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的抗原標(biāo)記方法，其特征在于，所述抗原標(biāo)記濃度根據(jù)式i確定，所述式i為：
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗原標(biāo)記方法，其特征在于，所述標(biāo)記物包括發(fā)光微球或生物素。
4.均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括在標(biāo)記物上標(biāo)記的抗原，其特征在于，所述抗原在標(biāo)記物上的標(biāo)記方法為權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗原標(biāo)記方法。
5.如權(quán)利要求4所述的均相發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述抗原包括谷氨酸脫羧酶...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬佳歡，徐明，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：三諾生物傳感股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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