【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于有效物質(zhì)，具體地說是一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人們在滿足基本的衣食住行之后開始關(guān)注自己的容顏，其中皮膚老化問題越來越受到人們的關(guān)注，皮膚老化一般有兩種表現(xiàn)形式，自然老化和光老化，自然老化主要是隨著年紀的增長，機體內(nèi)存在如遺傳、內(nèi)分泌以及免疫功能等不可抗因素引起的老化，光老化主要是由于紫外線的作用，以及氣候變化以及環(huán)境污染等外界因素，加快了衰老的過程。皮膚老化具體表現(xiàn)為皮膚彈性會慢慢降低，變得越來越薄、越來越松弛，皮膚出現(xiàn)色斑、皺紋等。因此需要保護皮膚免受外界環(huán)境的刺激，清除皮膚細胞內(nèi)多余的自由基，對皮膚細胞進行修復(fù)和補充相應(yīng)的營養(yǎng)，抗衰老的有效物質(zhì)就是實現(xiàn)皮膚抗老化功效的一個重要產(chǎn)品之一；
2、n-乙酰神經(jīng)氨酸是一種生物技術(shù)原料，作為一種天然糖類化合物，廣泛存在于脊椎動物、哺乳動物及多種植物組織中，尤其以燕窩和母乳中的含量最高，所以也被稱為“唾液酸”或“燕窩酸”，在有效物質(zhì)中能夠作為保濕劑、抗氧化劑、皮膚保護劑、抗皺劑等，可以用于全身的皮膚保養(yǎng)護理，是一種效果優(yōu)異的抗衰老成分。目前市場上主打抗衰老的有效物質(zhì)較多，但大部分抗衰效果一般，且添加n-乙酰神經(jīng)氨酸作為主打成分的功效性抗衰有效物質(zhì)較少，因此開發(fā)出含有n-乙酰神經(jīng)氨酸的抗衰有效物質(zhì)具有廣闊的市場前景。
3、為此，提出了一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，以及n-乙酰神經(jīng)氨酸在制備抗衰有效物質(zhì)中的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為
2、根據(jù)本公開的第一方面，提出一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，包括以下步驟：
3、s1、從供體生物中通過pcr技術(shù)擴增得到n-乙酰葡萄糖胺酸轉(zhuǎn)移酶和n-乙酰甘露糖胺酸合成酶的編碼基因，并將克隆得到的基因片段插入到畢赤酵母表達載體ppi?cz中；
4、s2、將構(gòu)建好的表達載體通過電穿孔法導(dǎo)入宿主酵母細胞中，利用載體上的抗生素抗性基因作為選擇性標記，在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上篩選成功轉(zhuǎn)化的畢赤酵母細胞；
5、s3、利用甲醇誘導(dǎo)的aox1啟動子在畢赤酵母中表達，對轉(zhuǎn)化成功的酵母菌株進行培養(yǎng)并誘導(dǎo)n-乙酰葡萄糖胺酸轉(zhuǎn)移酶和n-乙酰甘露糖胺酸合成酶的表達；
6、s4、發(fā)酵結(jié)束后，通過離心收集發(fā)酵液中含有n-乙酰神經(jīng)氨酸的酵母細胞，再通過高壓均質(zhì)或超聲波處理裂解細胞，釋放胞內(nèi)的n-乙酰神經(jīng)氨酸，并對裂解后的細胞懸浮液進一步分離和純化n-乙酰神經(jīng)氨酸。
7、優(yōu)選的，構(gòu)建表達載體ppicz時，利用限制性內(nèi)切酶切割基因片段和載體，使用dna連接酶將兩者連接起來形成重組表達載體。
8、優(yōu)選的，培養(yǎng)基中采用山梨醇和甘露醇與甲醇混合補料方式作為碳源，采用1％的大豆蛋白胨和0.02％天冬氨酸作為氮源。
9、優(yōu)選的，發(fā)酵過程中誘導(dǎo)溫度控制在24℃，ph值維持在5.0-6.5，采用純氧替代空氣，并采用指數(shù)-恒速補料策略進行營養(yǎng)物質(zhì)供給。
10、優(yōu)選的，所述指數(shù)-恒速補料策略是在發(fā)酵初期，當細胞處于快速生長期時，采用指數(shù)補料模式，補料速率隨著時間呈指數(shù)增長，表示為：f(t)＝f1(0)·eμt，其中f(t)表示t時間時的補料速率，f1(0)表示初始補料速率，μ表示所設(shè)定的比生長速率，t表示發(fā)酵過程中的時間；當進入恒速補料階段時，補料速率保持恒定。
11、優(yōu)選的，對裂解后的細胞懸濁液采用離子交換色譜去除雜質(zhì)，采用凝膠滲透色譜根據(jù)分子大小分離n-乙酰神經(jīng)氨酸，將純化后的n-乙酰神經(jīng)氨酸溶液進行結(jié)晶獲得高純度的固體產(chǎn)品。
12、根據(jù)本公開的第二方面，提出了一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法在制備抗衰有效物質(zhì)中的應(yīng)用，包括以下成分：無菌水、n-乙酰神經(jīng)氨酸、六勝肽、綠茶提取物、葡萄籽提取物、透明質(zhì)酸、甘油、角鯊?fù)椤⑾佘蘸退獯蠖沟鞍祝话凑召|(zhì)量比計為100：(2-5)：(0.5-2)：(0.5-1)：(0.5-1)：(0.5-1)：(2-5)：(1-3)：(0.1-0.5)：(1-3)。
13、優(yōu)選的，所述綠茶提取物具體提取過程包括以下步驟：將質(zhì)量比為100：1500的干燥綠茶粉末和乙醇進行混合加熱提取，加熱溫度為60℃-80℃，加熱時間為0.5h-2h，將加熱后提取液進行過濾，去除固體殘渣，再濃縮去除溶劑，得到濃縮的綠茶提取物，最后采用活性炭吸附，純化綠茶提取物。
14、優(yōu)選的，所述葡萄籽提取物具體提取過程包括以下步驟：將質(zhì)量比為100：2000的干燥葡萄籽粉末和乙醇進行混合加熱提取，乙醇濃度為70％，提取時間為1h-2h，再通過膜過濾方式純化處理，然后通過蒸發(fā)進行濃縮和干燥，得到葡萄籽提取物。
15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果：
16、1、本專利技術(shù)通過利用pcr技術(shù)擴增得到n-乙酰葡萄糖胺酸轉(zhuǎn)移酶和n-乙酰甘露糖胺酸合成酶的編碼基因，并將這些基因插入到畢赤酵母表達載體中，可以大量生產(chǎn)這兩種關(guān)鍵酶，提高了酶的生產(chǎn)效率，還降低了生產(chǎn)成本；并通過優(yōu)化畢赤酵母的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，有效提高了n-乙酰葡萄糖胺酸轉(zhuǎn)移酶和n-乙酰甘露糖胺酸合成酶的產(chǎn)量和活性。
17、2、本專利技術(shù)采用n-乙酰神經(jīng)氨酸、六勝肽、綠茶提取物、葡萄籽提取物、透明質(zhì)酸、甘油、角鯊?fù)椤⑾佘蘸退獯蠖沟鞍字苽溆行镔|(zhì)，具有保濕和抗氧化功效，并通過六勝肽促進膠原蛋白的生成，有助于減少細紋和皺紋的出現(xiàn)，具有長效保濕和抗衰老效果。
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1.一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：構(gòu)建表達載體pPICZ時，利用限制性內(nèi)切酶切割基因片段和載體，使用DNA連接酶將兩者連接起來形成重組表達載體。
3.如權(quán)利要求1所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：培養(yǎng)基中采用山梨醇和甘露醇與甲醇混合補料方式作為碳源，采用1％的大豆蛋白胨和0.02％天冬氨酸作為氮源。
4.如權(quán)利要求1所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：發(fā)酵過程中誘導(dǎo)溫度控制在24℃，pH值維持在5.0-6.5，采用純氧替代空氣，并采用指數(shù)-恒速補料策略進行營養(yǎng)物質(zhì)供給。
5.如權(quán)利要求4所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：所述指數(shù)-恒速補料策略是在發(fā)酵初期，當細胞處于快速生長期時，采用指數(shù)補料模式，補料速率隨著時間呈指數(shù)增長，表示為：F(t)＝F1(0)·eμt，其中F(t)表示t時間時的補料速率，F(xiàn)1(0)表示初始補料速率，μ表示所設(shè)定的比生長速率，t表示發(fā)酵過程中的時間；當進入恒速補料階段時，補料速
6.如權(quán)利要求1所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：對裂解后的細胞懸濁液采用離子交換色譜去除雜質(zhì)，采用凝膠滲透色譜根據(jù)分子大小分離N-乙酰神經(jīng)氨酸，將純化后的N-乙酰神經(jīng)氨酸溶液進行結(jié)晶獲得高純度的固體產(chǎn)品。
7.如權(quán)利要求1-6任一項所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法在制備抗衰有效物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：包括以下成分：無菌水、N-乙酰神經(jīng)氨酸、六勝肽、綠茶提取物、葡萄籽提取物、透明質(zhì)酸、甘油、角鯊?fù)椤⑾佘蘸退獯蠖沟鞍祝话凑召|(zhì)量比計為100：(2-5)：(0.5-2)：(0.5-1)：(0.5-1)：(0.5-1)：(2-5)：(1-3)：(0.1-0.5)：(1-3)。
8.如權(quán)利要求7所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法在制備抗衰有效物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述綠茶提取物具體提取過程包括以下步驟：將質(zhì)量比為100：1500的干燥綠茶粉末和乙醇進行混合加熱提取，加熱溫度為60℃-80℃，加熱時間為0.5h-2h，將加熱后提取液進行過濾，去除固體殘渣，再濃縮去除溶劑，得到濃縮的綠茶提取物，最后采用活性炭吸附，純化綠茶提取物。
9.如權(quán)利要求7所述一種N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法在制備抗衰有效物質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述葡萄籽提取物具體提取過程包括以下步驟：將質(zhì)量比為100：2000的干燥葡萄籽粉末和乙醇進行混合加熱提取，乙醇濃度為70％，提取時間為1h-2h，再通過膜過濾方式純化處理，然后通過蒸發(fā)進行濃縮和干燥，得到葡萄籽提取物。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：構(gòu)建表達載體ppicz時，利用限制性內(nèi)切酶切割基因片段和載體，使用dna連接酶將兩者連接起來形成重組表達載體。
3.如權(quán)利要求1所述一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：培養(yǎng)基中采用山梨醇和甘露醇與甲醇混合補料方式作為碳源，采用1％的大豆蛋白胨和0.02％天冬氨酸作為氮源。
4.如權(quán)利要求1所述一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：發(fā)酵過程中誘導(dǎo)溫度控制在24℃，ph值維持在5.0-6.5，采用純氧替代空氣，并采用指數(shù)-恒速補料策略進行營養(yǎng)物質(zhì)供給。
5.如權(quán)利要求4所述一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：所述指數(shù)-恒速補料策略是在發(fā)酵初期，當細胞處于快速生長期時，采用指數(shù)補料模式，補料速率隨著時間呈指數(shù)增長，表示為：f(t)＝f1(0)·eμt，其中f(t)表示t時間時的補料速率，f1(0)表示初始補料速率，μ表示所設(shè)定的比生長速率，t表示發(fā)酵過程中的時間；當進入恒速補料階段時，補料速率保持恒定。
6.如權(quán)利要求1所述一種n-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法，其特征在于：對裂解后的細胞懸濁液采用離子交換色譜去除雜質(zhì)，采用凝膠滲透色譜根據(jù)分子大小分離...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李宏峰，
申請(專利權(quán))人：廣州雙溢生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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